[发明专利]一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体为一种制备人妊娠特异性糖蛋白9的方法。

背景技术

妊娠特异性糖蛋白(Pregnancy specific glycoprotein，PSG)是一种糖基化蛋白，具有复杂的蛋白质三级结构，是癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)家族的成员。但是，目前对PSG家族研究较少。PSGs共包含11个成员，各成员间蛋白质序列保守性较强，同CEA家族蛋白一样，都含有免疫球蛋白样结构域(domain)，且是该蛋白的主要结构域。通过研究也发现，PSG1可能参与胚胎期血管生成。另外，还发现PSG蛋白另一项重要的功能是可以通过转化生长因子(Transfer growth factor，TGF)-beta，参与免疫反应，且能够抑制结肠炎症的发生。

PSG9是PSG蛋白的一种异构体，该基因也称为PSG7或PSG11，在蛋白质序列的N-端含有血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)样结构域。PSG9蛋白是制备抗PSG9单克隆抗体的必备材料，同时，也是后期建立检测人血液或组织中PSG9蛋白酶联免疫吸附试剂盒的标准品。Salahshor等通过基因芯片技术发现：PSG9在结直肠癌组织中高表达。对已经公布的表达谱芯片数据分析也发现，在肺癌中，PSG9 mRNA表达上调。多种肿瘤细胞系中也发现了PSG9蛋白的表达。PSG9是一种分泌型蛋白，在血浆中可以检测到。有研究报道在肝细胞癌中，PSG9血浆含量显著高于健康人群。据此，推测PSG9可能促进肿瘤发生发展。但是，对于PSG9在肿瘤发生中的作用仍不清楚。

目前，还未见有研究者表达全长的人PSG9蛋白，用于研究其功能。对于PSG9功能的挖掘很大程度受限于：没有一种稳定、特异性强的抗体，来分析PSG9在肿瘤组织的表达，构建酶联免疫吸附反应(ELISA)试剂盒，相互作用蛋白等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备人PSG9蛋白的方法。

本发明所提供的制备人PSG9蛋白的方法包括如下步骤：

(1)构建重组菌：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中，得到重组菌；

(2)重组菌诱导培养：将重组菌用IPTG进行诱导培养，IPTG在菌液中的浓度为3uM，诱导培养的温度为30℃，得到诱导后菌体；

(3)蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取上清；将上清用镍柱进行纯化，纯化过程中使用的洗脱液是含有40nM咪唑的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即得到人PSG9蛋白。

上述所述人PSG9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中自N端起第1-426位氨基酸所示。

上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。

上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21α-His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。

本发明的另一个目的是提供一种用于制备人PSG9蛋白的重组菌。

本发明所提供的制备人PSG9蛋白的重组菌的具体步骤：将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中获得的。

上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

上述所述人PSG9蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1中第1-1278位核苷酸的DNA分子所示。

上述所述将人PSG9蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中的方法为：将所述人PSG9蛋白的编码基因插入载体pET-21α-His的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主大肠杆菌中。

实验结果表明，本发明方法制备得到的人PSG9蛋白的纯度高，可达27.3mg/L，为后续PSG9在癌症中作用机制研究以及获得高纯度的单克隆抗体奠定了基础。

附图说明

图1为PSG9基因克隆双酶切(NheI、HindIII)鉴定。共挑取4个单克隆；M为DNA分子量Marker(bp)。