[发明专利]猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体，属于生物基因工程领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，其流行趋势发生了很大的变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，以及猪瘟疫苗免疫失败的现象。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪瘟病毒同属黄病毒科、瘟病毒属成员。BVDV不仅感染牛，而且能感染猪、绵羊、山羊及野生动物，很多国家地区的研究证实了BVDV在猪群中存在不同程度的感染。猪感染BVDV可出现类似猪瘟的临床症状和病理变化，导致繁殖障碍、产仔数下降和流产。此外，先天性感染的仔猪出生后还可能形成持续感染和免疫耐受，并长期带毒。

目前，世界各国主要推广使用的猪瘟疫苗为弱毒疫苗，这种疫苗存在安全性不高，无法区分野毒感染和免疫接种，以及弱毒疫苗返强等缺陷。当前控制BVDV感染的手段为传统的灭活疫苗和基因修饰弱毒疫苗接种，但灭活疫苗只能起到部分保护，而BVDV基因修饰弱毒疫苗会抑制机体淋巴细胞和中性粒细胞的活性，产生免疫抑制，增强其他病毒的致病力。此外，在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生产过程中，使用BVDV污染的血清，造成了疫苗的污染更增加了病毒的潜在传播。

近年来，本领域也开始尝试使用病毒活载体疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型疫苗，但这类疫苗无法避免使用过程中基因重组的问题，导致其防治效果不稳定。

因此本领域亟待发明一种可以长期使用而不产生毒力返强，培养生产过程中避免使用血清，并且能有效预防和控制猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒感染的多价亚单位疫苗。

发明内容

针对现有技术的需要，本发明公开了一种猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的主要囊膜蛋白(E2)和非结构蛋白(NS2-3)共表达载体，能够在宿主菌中同时表达CSFV主要囊膜蛋白(E2_c)和非结构蛋白(NS2-3_c)及BVDV主要囊膜蛋白(E2_b)和非结构蛋白(NS2-3_b)，并且蛋白的免疫原性不受破坏和改变。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体，是在同一宿主菌中表达的双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1，二者分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2_c和非结构蛋白NS2-3_c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2_b和非结构蛋白NS2-3_b的编码基因，双表达载体与编码基因的连接关系为pETDuet-E2_c-NS2-3_c和pRSFDuet-NS2-3_b-E2_b。

本发明所用的载体pETDuet-1、pRSFDuet-1是双表达载体，每一个载体上有两个启动子，属于单一载体双启动子系统，每一个蛋白的编码基因都有独立的一个启动子，每个启动子独立驱动外源蛋白的表达。

与传统的构建融合基因相比，本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响，保证了蛋白稳定表达，克服了串联表达表达量不足的缺点。并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统，pETDuet-1和pRSFDuet-1作为复制子相同不相容的两个质粒，在Amp和Kana两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活，不会被抗生素杀死，从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源基因。

为了便于规模化生产，降低培养难度，本发明所用的宿主菌为大肠杆菌，其培养简单，可以采用发酵罐实现规模化生产，从而有效控制质量，保证疫苗生产的安全性和有效性。

常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明，包括大肠杆菌BL21(DE3)，和BL21(DE3)PLySs等。