[发明专利]一株抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其产生抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体的应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

甲羟孕酮（Medroxyprogesterone，MP）属于孕激素，作用与天然黄体酮类似，是人工合成的黄体酮衍生物，因此又称为安宫黄体酮。医学方面，主要是用于痛经、功能性闭经、习惯性流产等，大剂量可以用作长效的避孕针。畜牧养殖方面，主要用来促进动物生长，但是长期大量使用会对动物体造成危害。目前，很多国家都规定饲养动物禁止使用激素，我国也出台相应的政策禁止激素类的使用。现有的检测MP方法包括高效液相色谱法（HPLC）、液质联用（LC-MS）、气质联用（GC-MS）等。尽管这些方法灵敏度高，但是繁琐的前处理步骤，检测的高费用，都无法满足现场大批量快速检测的需求。相比较，酶联免疫分析技术（ELISA）提供了一种检测MP快速、灵敏、简便的方法。在目前MP免疫检测方法中，关键是单克隆抗体对MP的高特异性和高灵敏度，以致于难以得到准确客观的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一株抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株制备的单克隆抗体对MP具有较好的特异性和较高的检测灵敏度，为建立MP的免疫学检测方法奠定基础。

本发明的技术方案，一株抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为单克隆细胞株E号，又称杂交瘤细胞株4F9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9305，保藏日期为2014年5月28日。

所述抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的应用，免疫得到的抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体，甲羟孕酮的50% 抑制浓度IC₅₀为0.067ng/mL，与其他类似物交叉反应率均小于0.1%。

本发明提供4F9细胞株的基本制备过程：

（1）甲羟孕酮免疫原的制备与鉴定：甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原（MP-2CME），LC-MS鉴定结果。利用混合酸酐法将其与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）或者鸡血清白蛋白（OVA）偶联，用紫外鉴定结果；

（2）小鼠的免疫过程：将抗原与福氏完全佐剂同比例混合，完全乳化后，通过背部皮下多点注射免疫8-10周BALB/c小鼠，每只剂量100μL。免疫过程共五次：第一次用福氏完全佐剂免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂，最后一次用生理盐水稀释免疫原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：冲击免疫后第三天，通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA法检测分泌MP的细胞株，利用间接竞争ELISA法测定该细胞株的抑制效果，筛选最好抑制的阳性细胞株进行三次亚克隆，最终获得杂交瘤细胞株4F9；

（4）杂交瘤细胞株的应用：将所得到的单克隆抗体配置在检测MP的免疫试剂盒中，也将该抗体制成用于检测MP的胶体金免疫试纸条。

免疫得到的抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体，免疫所用之甲羟孕酮半抗原（MP-2CME）的制备步骤如下：甲羟孕酮0.1mmol溶解于3mL无水二甲亚砜为A液，二溴乙酸0.2mmol溶解于1.4mL无水二甲亚砜为B液，A液中加入氢氧化钾粉末1.5mmol，室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原MP-2CME粉末。

免疫所用之甲羟孕酮完全抗原的制备步骤如下：称取甲羟孕酮半抗原0.01mmol溶解于600μL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF，置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入0.025mmol氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌1h，得活化后小分子溶液C液；称取载体蛋白BSA 0.00016mmol溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴条件下，将C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h；反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮完全抗原混合液。

将免疫得到的抗甲羟孕酮特异性单克隆抗体应用于制备甲羟孕酮的免疫检测试剂盒。

所述试剂盒包括胶体金免疫试纸条和试剂；

胶体金免疫试纸条：衬板1、样品垫2、结合垫3、吸水垫4和包被膜5；在衬板1上依次衔接黏附样品垫2、结合垫3、包被膜5和吸水垫4；