[发明专利]一种通过改善细胞通透性生产L(+)-酒石酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种生产L(+)-酒石酸的方法。

背景技术

L(+)-酒石酸广泛存在于自然界中，特别是葡萄和罗望子果中，被称为“天然酒石酸”，是重要的食品添加剂、医药拆分剂、印染防染剂、照相显影剂、金属离子屏蔽剂等。微生物转化法是目前L(+)-酒石酸生产的主要方法，即以含顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物，转化底物顺式环氧琥珀酸为L(+)-酒石酸。

现有技术已经构建了表达顺式环氧琥珀酸水解酶的重组细胞，但是直接用重组细胞生产L(+)-酒石酸主要存在以下2个问题：

（1）重组细胞的顺式环氧琥珀酸水解酶虽高效表达，但由于顺式环氧琥珀酸水解酶属于胞内酶，与底物接触的机会受制于细胞膜的通透性，导致其催化性能低。

（2）重组细胞只能使用一次，利用率低下，成本高，污染大。

表面活性剂，是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。它是一大类有机化合物，它们的性质极具特色，应用极为灵活、广泛，有很大的实用价值和理论意义。

固定化微生物细胞是20世纪60年代酶学领域崛起的新技术，利用化学或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间区域,以利于细胞内的一种酶或多种酶进行生物催化,并保持细胞活性,可反复使用的一种技术。与传统游离细胞相比，固定化细胞具有单位体积的菌体密度高、菌体易回收等优点。目前国内外还没有关于先使用表面活性剂对重组细胞进行通透化处理，进而利用处理后的重组细胞进行L(+)-酒石酸生产的报道，因此利用表面活性剂改善细胞通透性，结合固定化技术提高细胞使用率，对L(+)-酒石酸的生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的改善细胞通透性生产L(+)-酒石酸的方法，以克服现有技术的全部或部分缺陷。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明通过改善细胞通透性生产L(+)-酒石酸的方法包括如下步骤：（1）发酵培养表达顺式环氧琥珀酸水解酶的重组细胞；（2）使用曲拉通系列表面活性剂作为通透剂对所述重组细胞进行通透化处理；（3）利用通透化处理过的重组细胞来生产L(+)-酒石酸。

进一步地，本发明在利用通透化处理过的重组细胞生产L(+)-酒石酸之前，先将该通透化处理过的重组细胞使用κ-卡拉胶固定化。

进一步地，本发明将通透化处理过的重组细胞使用κ-卡拉胶固定化的方法如下：

将通透化处理过的重组细胞悬液加入κ-卡拉胶溶液中混匀，冷却凝固后用氯化钾溶液浸泡固定，其中，κ-卡拉胶的终浓度为20-60g/l，通透化处理过的重组细胞的终浓度为10-50g/l。

进一步地，本发明所述κ-卡拉胶的终浓度为30-50g/l，通透化处理过的重组细胞的终浓度为20-30g/l。

进一步地，本发明在所述步骤（2）中，对所述重组细胞进行通透化处理的方法为：将步骤（1）所培养的重组细胞用含有曲拉通系列表面活性剂的生理盐水悬浮，所述表面活性剂的作用浓度为0.01 - 50 g/L；然后静置或慢速搅拌悬浮液10 min - 24 h。

进一步地，本发明所述表面活性剂的作用浓度为0.1 - 10 g/L，静置或慢速搅拌悬浮液30 min - 5 h。

进一步地，本发明所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

进一步地，本发明所述非离子表面活性剂为以下的任意一种：失水山梨醇脂肪酸酯系列表面活性剂（司盘系列，商品名Span）、聚山梨酯系列表面活性剂（吐温系列，商品名Tween）、聚乙二醇对异辛基苯基醚系列表面活性剂（曲拉通系列，商品名Triton）、烷基酚聚氧乙烯醚系列表面活性剂（商品名OP）、月桂醇聚氧乙烯醚系列表面活性剂（商品名AEO）。

进一步地，本发明所述非离子表面活性剂优选为聚乙二醇对异辛基苯基醚系列表面活性剂。

进一步地，本发明所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100。

相对于现有技术，本发明所取得的有益效果在于：

1．本发明利用经表面活性剂处理的顺式环氧琥珀酸水解酶重组细胞生产L(+)-酒石酸，与未经表面活性剂处理的重组细胞相比，顺式环氧琥珀酸水解酶重组细胞的转化时间最高缩短了12倍以上。