[发明专利]一种水稻种胚RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域水稻种胚RNA的提取方法。

背景技术

近年来，随着生物技术的进步和发展，基因的克隆和表达研究，需要从植物材料中提取高纯度的RNA。作为植物分子生物学的基本实验技术，尽管RNA的提取技术已经很成熟，但在实际研究中经常很难做到顺利获得高质量的RNA。其中涉及到很多因素，包括材料保存是否合理，器具处理及操作是否严格等，这些因素都容易造成RNA降解。此外，有些植物组织中富含多糖、脂质及酚类物质，往往不利于RNA的分离和纯化。植物的种子中富含脂质、储存蛋白和酚类等次生代谢物质，这些物质都不利于RNA的提取。目前市面上出售的植物总RNA提取试剂盒众多，但均存在一定的缺陷，如提取时间长，提取所需条件较苛刻，提取率低，提取的总RNA完整性较差等缺点。

水稻（OryzaSativaL.）是全球重要粮食作物之一，世界上有超过50%的人口以大米为主食。为培育出高产、优质、抗性好、环境适应性强、营养利用率高的优质水稻新品种，分子生物学方法得到了广泛的应用。本发明提出了一种高效、高质量提取水稻种胚RNA的方法，以期为水稻基因组学研究奠定重要的工作基础。

发明内容

本发明目的是提供一种水稻种胚RNA的提取方法。

本发明的技术方案在于：水稻种胚RNA的提取方法，其特征在于：按照一下步骤进行：

(1)将10粒种子剥胚，将胚装入EP管中，立即加入200ulTripure（Roche），用尖头玻璃棒快速捅碎，加入800ulTripure，迅速快速颠倒振荡30s以上，室温静置10min；

(2)加入200ul的氯仿，颠倒振荡使两相充分混合，室温静置10min；

(3)4℃12000g离心10min，吸取上清约450ul加入等量冰异丙醇，轻轻颠倒振荡充分混合，室温静置10min；

(4)4℃12000g离心15min，弃上清并加入1ml75％乙醇，轻轻吹打沉淀，使之飘起，4℃12000g离心3min，弃上清；

(5)重复步骤(4)，500ul乙醇即可；

(6)将空管12000g离心2min，吸干余液，放置大约30s（时间太长RNA很难复溶），立即加入30-60ulRNase-freewater，轻轻吹打数次，使沉淀溶解，随后水浴65℃5min使其充分溶解并打开二级结构；

(7)如果RNA不立即使用，步骤6加入乙醇后，放置－20℃保存（可存数月），待用时，取出4℃离心后弃上清进行步骤7；

(8)溶解的RNA最好立即测定OD，跑电泳，操作必需在冰上进行。RNA可保存在－20℃短期保存（三个月之内）或-80℃长期保存。如果RNA重新冻融必须吹打混匀后进行后续实验。

上述操作步骤需要全程带口罩，PE手套要经常换。

所述步骤(1)前在提取区域用75%酒精喷洒，实验台用酒精棉擦拭。

所述步骤(1)中迅速快速颠倒振荡30s以上，如果多个样品，磨一个样加一个。

所述步骤(3)中吸取的最多不超过550ul，以防DNA污染。

所述步骤(3)样品太少可放置－80度或－20度，提高RNA产量。

2、本发明的优点在于：提取的水稻种胚RNA中5S，18S和28S条带清晰，完整性好，利用Nanodrop2000超微量分光光度计测获得A260/A280比值均在1.95~2.1之间和A260/A230的比值均约2.0，表明提取的RNA质量好，可以用于后续实验。

附图说明

图1实施例的RNA电泳图。

具体实施方式

下文通过具体实施案例对本发明做进一步说明。

实施案例1

水稻种胚RNA的提取：

实验所需用品包括研钵，药匙，镊子，1.5mlEP管，PCR管，枪头用0.1％DEPC水泡过夜，120℃高压1h，烘干存放，研钵使用前用酒精烧或180高温灭菌6h以上。具体操作步骤如下：

(1)取40粒水稻种子，分成四等份，每份10粒。用清水处理0h、3h、6h、12h；

(2)将上述四组种子依次剥胚，分别胚装入EP管中，加入200ulTripure（Roche），用尖头玻璃棒快速捅碎，加入800ulTripure，迅速快速颠倒振荡40s以上，室温静置10min；

(3)加入200ul的氯仿，颠倒振荡使两相充分混合，室温静置10min；