[发明专利]高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法

权利要求书

1.一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，包括：

将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转入感受态大肠杆菌细胞中；

利用耐药基因分离出感受性相对较高的大肠杆菌，然后使个别的所述感受性相对较高的大肠杆菌将驯化质粒丢失，再利用负筛选基因分离出将驯化质粒丢失的大肠杆菌；

使用所述驯化质粒循环往复地对所述将驯化质粒丢失的大肠杆菌进行多轮筛选，从而制备得到高感受态的大肠杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述驯化筛选方法包括：

1)将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转化入感受态大肠杆菌细胞中；

2)将转化后的菌液涂布于含有与所述驯化质粒所携带的耐药基因相应的抗生素的LB固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；

3)收集步骤2)中获得的菌斑，将其接种于LB液体培养基后过夜培养，使个别大肠杆菌将驯化质粒丢失；

4)将步骤3)中获得的菌液涂布于含有与所述负筛选基因相应的杀菌物质的LB固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；

5)收集步骤4)中获得的菌斑，制备感受态大肠杆菌；

6)将所述携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒再次转入步骤5)的感受态大肠杆菌细胞中，依次重复步骤2)～步骤4)；

7)将步骤5)和6)按顺序循环，直至得到高感受态的大肠杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中驯化质粒的用量为所述步骤6)中驯化质粒的用量的500～2000倍。

4.根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤4)中的培养温度为30～37℃。

5.根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养温度为40～45℃。

6.根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述驯化过程的循环轮数为12～16轮。

7.根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株选自DH5alpha，TOP10和BL21中的一种。

8.根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述驯化质粒的骨架选自pET28，puc18和puc19中的一种。

9.根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述耐药基因选自卡那霉素基因，氨苄青霉素基因，氯霉素基因和红霉素基因中的一种。

10.根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述负筛选基因选自sacB基因，rpsL(strA)基因，tetA基因，pheS基因，thyA基因，lacy基因，gata-1基因和mazF基因中的一种。