[发明专利]高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与微生物学领域，特别是涉及一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法。

背景技术

质粒转化大肠杆菌是基因克隆的必须步骤之一。质粒是双链环状DNA，一般包含数千到数万个碱基对，常天然存在与细菌体内。质粒可在细菌体内以数个至数百拷个贝数存在，并作为编码一定表现型的遗传物质随细菌的分裂增殖稳定遗传给子代细菌，在细菌群体中稳定存在。以质粒为载体的基因克隆是遗传工程科研与生产的基本方法之一。其基本原理是以人工改造过的质粒为载体，在体外将目的基因DNA片段连接、插入质粒DNA之中获得重组质粒后，再将重组质粒转化入大肠杆菌之中。利用质粒可在大肠杆菌体内复制、增殖的特点，并利用质粒自身编码的抗性基因表型在抗生素培养基中对细菌进行筛选培养，最终获得纯系的，携带有大量重组质粒的大肠杆菌，从而实现目标基因的克隆增殖。在此过程中，将体外重组的质粒DNA转化入大肠杆菌是关键步骤之一。这一步骤的效率越高，基因克隆的成功机会就越高。这一效率通常以在转化实验中使用一微克质粒DNA所能获得的大肠杆菌克隆数(CFU)来表示。一般地，从每微克质粒DNA获得10⁶CFU是获得成功转化的最低要求。当转化效率达到10⁸至10⁹CFU每微克质粒DNA时，克隆工作即可获得稳定地成功保障。在某些工作中，比如鸟枪法构建基因库，感受态细菌的转化效率对最终基因库的质量有着关键的影响。只有当转化效率达到10⁸～10⁹CFU每微克质粒DNA时，所构建的基因库才能合格。

大肠杆菌在自然状态下无法接受外源质粒DNA。因此，在质粒转化前必须先对大肠杆菌进行一定的处理，使其成为易于接受外源质粒DNA的状态，即感受态大肠杆菌。

目前科研与生产中所使用的工具大肠杆菌有多种菌株，它们的遗传背景各不相同，生理特性也有差异，这些差异分别有利于各类科研与生产目的。这些菌株对感受态制备方法的反应各不相同。因此，不同的制备方法对同一菌株，同一方法对不同的菌株，感受态细菌的制备效果均有显著差异。即使对易于形成感受态的菌株，如，DH5alpha而言，只有制备过程复杂，工艺要求教高(需要液氮)的方法才能获得较好的感受态制备效果(达到或高于10⁸CFU每微克质粒DNA)。而较简单的制备方法，如，氯化钙法，通常只能达到10⁶CFU每微克质粒DNA。对难于形成感受态的菌株，如，BL21，现有任何方法均不能获得很满意的感受态制备效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，通过多轮选择性筛选的方法，获得易于制备高效感受态细菌的超级感受大肠杆菌菌株，以提高基因克隆过程中质粒DNA对大肠杆菌的转化效率。

基于上述目的，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法包括：

将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转入感受态大肠杆菌细胞中；

利用耐药基因分离出感受性相对较高的大肠杆菌，然后使个别的所述感受性相对较高的大肠杆菌将驯化质粒丢失，再利用负筛选基因分离出将驯化质粒丢失的大肠杆菌；

使用所述驯化质粒循环往复地对所述将驯化质粒丢失的大肠杆菌进行多轮筛选，从而制备得到高感受态的大肠杆菌菌株。

可选地所述驯化筛选方法包括：

1)将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转化入感受态大肠杆菌细胞中；

2)将转化后的菌液涂布于含有与所述驯化质粒所携带的耐药基因相应的抗生素的LB固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；

3)收集步骤2)中获得的菌斑，将其接种于LB液体培养基后过夜培养，使个别大肠杆菌将驯化质粒丢失；

4)将步骤3)中获得的菌液涂布于含有与所述负筛选基因相应的杀菌物质的LB固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；

5)收集步骤4)中获得的菌斑，制备感受态大肠杆菌；

6)将所述携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒再次转入步骤5)的感受态大肠杆菌细胞中，依次重复步骤2)～步骤4)；

7)将步骤5)和6)按顺序循环，直至得到高感受态的大肠杆菌菌株。

较佳地，所述步骤1)中驯化质粒的用量为所述步骤6)中驯化质粒的用量的500～2000倍。

优选地，所述步骤2)和步骤4)中的培养温度为30～37℃。

较佳地，所述步骤2)中的培养温度为40～45℃。