[发明专利]解淀粉芽孢杆菌WZZ002及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种酶法分解外消旋Boc-DL-氨基酸酯制备手性中间体的方法，特别涉及在解淀粉芽孢杆菌WZZ002(CCTCC M 2013366)产生的酯水解酶作用下进行立体选择性水解反应合成光学纯Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸的方法。

(二)背景技术

N-叔丁氧羰基-D-氨基酸酯(简称Boc-D-氨基酸酯)和N-叔丁氧羰基-L-氨基酸(简称Boc-L-氨基酸)是一种重要的生化试剂，用于多肽合成和氨基酸保护单体。Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸酯可以通过化学水解获得对应的D-氨基酸和L-氨基酸。D-氨基酸作为非天然氨基酸，在医药和农药合成，食品，饲料等方面具有广泛的用途。其中D-丙氨酸一种重要的医药中间体，广泛用于医药和食品添加剂等领域，主要用于合成新型甜味剂阿力甜(L-天门冬酰-N-(2,2,4,4-四甲基-3-硫杂环丁基)-D-丙氨酰胺)及某些手性药物中间体的原料。其中L-正缬氨酸是抗高血压类药物培哚普利的重要中间体。L-2-氨基丁酸是抗癫痫药物左乙拉西坦的重要中间体。

目前，文献报道的合成Boc-D-丙氨酸酯通过D-丙氨酸为底物Boc取代酯化后获得。其中D-丙氨酸的合成方法主要是化学拆分法。化学拆分工艺途径存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物纯度较低、污染严重等问题。而酶法制备D-丙氨酸方法主要有：(1)以化学合成的5-甲基海因为底物，利用海因裂解酶制备；(2)化学合成的乙酰或苯乙酰-DL-丙氨酸为底物，利用氨基酰化酶或者青霉素酰化拆分；(3)以DL-丙氨酸为底物，微生物降解法；(4)以丙酮酸为底物，利用氨基转移酶制备。目前生物法制备D-丙氨酸存在着酶选择性不高，生产成本高，前体底物合成难等问题。

(三)发明内容

本发明目的是通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一株廉价高效的产微生物酶菌株，以外消旋Boc-DL-氨基酸酯为反应底物，催化立体选择性水解Boc-DL-氨基酸酯中L-异构体从而制备Boc-D-氨基酸酯和Boc-L-氨基酸的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WZZ002，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC M 2013366，保藏日期2013年8月8日。

本发明还涉及一种所述解淀粉芽孢杆菌WZZ002在拆分N-叔丁氧羰基-DL-氨基酸酯中的应用，具体所述的应用为：以解淀粉芽孢杆菌WZZ002经发酵培养获得的湿菌体冻干后的干菌体为催化剂，以外消旋N-叔丁氧羰基-DL-氨基酸酯(即Boc-DL-氨基酸甲酯)为底物，于pH值为6～9(优选pH值为7.0)的磷酸缓冲液中，在20～50℃(优选30℃)下进行转化反应，反应结束后，将反应液后处理，获得N-叔丁氧羰基-D-氨基酸酯(Boc-D-氨基酸酯)和N-叔丁氧羰基-L-氨基酸(Boc-L-氨基酸)。

进一步，所述干菌体的质量用量为1～50g/L缓冲液，优选10～20g/L，所述初始底物浓度为1～200g/L缓冲液，优选50～100g/L。

进一步，优选所述底物为N-叔丁氧羰基-DL-丙氨酸酯(Boc-DL-丙氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-2-氨基丁酸酯(Boc-DL-2-氨基丁酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-正缬氨酸酯(Boc-DL-正缬氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-蛋氨酸酯(Boc-DL-蛋氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-脯氨酸酯(Boc-DL-脯氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-丝氨酸酯(Boc-DL-丝氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-亮氨酸酯(Boc-DL-亮氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-异亮氨酸酯(Boc-DL-异亮氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-苏氨酸酯(Boc-DL-苏氨酸酯)、N-叔丁氧羰基-DL-色氨酸酯(Boc-DL-色氨酸酯)或N-叔丁氧羰基-DL-苯丙氨酸酯(Boc-DL-苯丙氨酸酯)。

进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养