[发明专利]一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒样颗粒领域，尤其涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)属于虹彩病毒科，可以使多种鱼类得传染性脾肾坏死病，造成鳜鱼、石斑、卵形鲳鲹等大量死亡，感染后10天内死亡可达90％以上，给养殖鱼类带来很大的经济损失。

目前控制该病的最好方法为疫苗免疫，但国内外尚无有效药物。全病毒灭活疫苗的效果不理想，保护率一般不超过50％。日本、韩国有报道采用DNA疫苗控制与ISKNV相似的其它虹彩病毒，并取得一定的成效。但DNA疫苗的使用具有危险性，不能直接进入人类的食物链。有学者采用大肠杆菌表达ISKNV的结构蛋白，制备亚单位疫苗，取得一定的效果，但也达不到产业生产对疫苗的要求。因此，提高ISKNV基因工程疫苗的免疫效力，开发新的疫苗具有紧迫性。

科学研究证明病毒样颗粒(VLPs)具有很好的免疫效力和应用前景。VLPs是含有某种病毒的一个或多个主要结构蛋白，在体外表达系统中自动组装成的不包含病毒核酸的空心颗粒。流感病毒的表面膜蛋白HA是引起机体产生免疫应答的主要诱发物，而基质蛋白M1是形成病毒外壳的主体，亦可作为组织型免疫应答的诱发物。有关的研究证明，基质蛋白M1的正确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节。M1蛋白和HA这2个主要结构蛋白同时表达就可以自动组装成空心的没有病毒基因组的病毒样颗粒。VLPs的形态和大小与真实的病毒粒子相同或相似，所以能有效的诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，作为一种新型疫苗显示出了良好的应用前景。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述疫苗效力差等问题，提供一种传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒，由同时表达的流感病毒基质蛋白M1和融合蛋白HA-24构成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白与鱼类传染性脾肾坏死病毒ORF24构建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID NO:3、5、7、9或11所示。

一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

①将传染性脾肾坏死病毒主要结构蛋白ORF24基因替换流感病毒HA基因的一部分，二者构成融合基因HA-24，融合基因HA-24的核酸序列如SEQ ID NO:3、5、7、9或11所示；

②将流感病毒的基质蛋白M1基因和融合蛋白HA-24基因插入昆虫杆状病毒pFastBac-Dual载体上，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，并转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid；

③利用脂质体转染试剂，将含外源基因的重组杆状病毒穿梭载体rBacmid转染入宿主昆虫细胞株sf-9中，获得重组昆虫杆状病毒；

④培养受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞，使其得以高效地表达流感病毒的结构蛋白M1和融合蛋白HA-24，并自动组装成同时表达流感病毒基质蛋白M1和融合蛋白HA-24的病毒样颗粒。

优选地，步骤①中的HA-24基因是由传染性脾肾坏死病毒ORF24与流感病毒HA基因先合成融合基因，然后用PCR扩增而成。

优选地，步骤③中sf-9细胞在27℃培养4-5天，收集细胞培养上清液，再侵染新的sf-9细胞，获得放大后高滴度的重组昆虫杆状病毒。

优选地，步骤④中受重组昆虫杆状病毒转染的宿主昆虫细胞在27℃培养3天，表达的流感病毒M1蛋白和融合蛋白HA-24，自动组装成VLPs。

一种包含上述任一项所述的病毒样颗粒的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗。

本发明提供的抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法具有明显的优点和效果：

(1)VLPs疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能预防鱼类传染性脾肾坏死病毒病。

(2)病毒样颗粒不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内就不会发生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程不接触活的有感染力的病毒，因此非常安全。