[发明专利]一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法

权利要求书

1.一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于所述的T5外切酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：通过载体构建将密码子优化的T5核酸外切酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；所述T5核酸外切酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T5核酸外切酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T5 Exonuclease；所述融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于所述载体构建步骤具体为如下步骤：

引物设计如下：

所用正向引物为：

5’CATGGGATCCGACGACGACGACAAGATGAGCAAATCGTGGGGGAAATTCAT-3’；下划线部分为BamH I的酶切位点；

所用反向引物为：

5’-CATGCTCGAGTCACTGTTCTGCAATTTCGA-3’；下划线部分为Xho I的酶切位点；

在正向引物中有一个BamH I的酶切位点以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列，反向引物中有一个Xho I的酶切位点；以合成T5核酸外切酶基因为模板，用PCR的方法扩增T5核酸外切酶编码序列，PCR反应的条件为：94℃热变性一分钟，55℃退火一分钟，72℃延伸90秒，共进行25个循环；pGEX和纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进行双酶切，然后将PCR酶切片段回收插入pGEX的多克隆位点；pGEX是一个在N端融合GST-tag的原核表达载体；对重组表达载体pGEX-T5核酸外切酶进行DNA测序；分析其阅读框和编码序列的正确性。

4.根据权利要求2所述的一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于所述融合表达步骤具体为如下步骤：

将T5核酸外切酶融合蛋白表达载体pGEX-T5核酸外切酶转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l的氨苄青霉素的LB液体培养基；待细菌长至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导T5核酸外切酶的表达；16℃诱导12个小时后收集菌体。

5.根据权利要求2所述的一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于所述纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤：

收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的buffer A重悬，所述buffer A的构成为20mMTris-HCl，50mM NaCl，0.5％ Triton-X100，10％甘油，超声裂解细胞，离心取上清，上清通过buffer A预平衡的GST亲和柱，上样完毕用buffer A充分洗涤至基线，而后用buffer B洗脱目的蛋白，所述buffer B的构成为50mM Tris-HCl，20mM Reduced Glutathione，10％甘油；

将结合了GST-T5核酸外切酶透析后用EK酶切，按照EK(mg)∶目标蛋白(mg)＝1∶10000的比例将EK加入融合蛋白溶液中开始酶切反应，酶切条件为4℃，16小时，酶切溶液通过GST亲和柱收集流出液，流出液进一步经强阴离子交换吸附层析Q-Sepharose纯化。