[发明专利]一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种T5核酸外切酶(T5 Exonuclease)在大肠杆菌中的表达和纯化方法，属生物化学领域。

背景技术

核酸外切酶(exonucleautomotive service engineers)在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶，总对单一核苷酸链作用，在剪切修饰反应中起作用，与核酸内切酶相对应。可大致分为水解磷酸二酯键的3′端生成5′-单核苷酸的酶，及水解5′端生成3′-单核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大肠杆菌核酸外切酶I、II和III等；后者有脾脏磷酸二酯酶、嗜酸乳杆菌(Lac-tobacillus acidophilus)核酸酶。这些酶中还可以区别出从分子链的3′末端或5′末端开始切断和对单链DNA或双链DNA具有特异作用的酶。可利用这些酶水解方式的差异来分析核酸结构。T5核酸外切酶纯化自含T5噬菌体D15基因质粒的E.coli菌株，是核酸外切酶的一种，该酶能沿5′→3′方向降解DNA。它既能从5′末端起始消化，也能从线性或环状双链DNA的切刻或缺口处起始消化，但不能降解超螺旋双链DNA。T5核酸外切酶还具有单链DNA核酸内切酶活性。这些特性使得T5核酸外切酶常被用于消化DNA和基因克隆上。随着基因克隆技术的普及，T5核酸外切酶市场需求量越来越大，而天然T5核酸外切酶的提取技术复杂、成本高、产率低。

发明内容

本发明的目的是为解决上述困难，提供一种重组T5核酸外切酶(T5 Exonuclease)在大肠杆菌中可溶性表达及纯化方法，本发明将T5 Exonuclease基因做了密码子优化，通过载体构建将T5核酸外切酶基因和肠激酶酶切位点克隆到pGEX载体中，在16℃的诱导条件下T5核酸外切酶的表达量可以达到15％，而且可溶性达到95％。最后，通过GST标签纯化和肠激酶酶切来纯化得到不带任何标签的T5核酸外切酶。

本发明是以如下技术方案实现的：一种重组T5核酸外切酶，其特征在于的T5核酸外切酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

其制备方法包括如下步骤：通过载体构建将密码子优化的T5核酸外切酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；T5核酸外切酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T5核酸外切酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T5 Exonuclease；融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。

进一步的，载体构建步骤具体为如下步骤：

引物设计如下：

所用正向引物为：

5’-CATGGGATCCGACGACGACGACAAGATGAGCAAATCGTGGGGGAAATTCAT-3’；

所用反向引物为：

5’-CATGCTCGAGTCACTGTTCTGCAATTTCGA-3’；

在正向引物中有一个BamH I的酶切位点以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列，反向引物中有一个Xho I的酶切位点；以合成T5核酸外切酶基因为模板，用PCR的方法扩增T5核酸外切酶编码序列，PCR反应的条件为：94℃热变性一分钟，55℃退火一分钟，72℃延伸90秒，共进行25个循环；pGEX和纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进行双酶切，然后将PCR酶切片段回收插入pGEX的多克隆位点；pGEX是一个在N端融合GST-tag的原核表达载体；对重组表达载体pGEX-T5核酸外切酶进行DNA测序；分析其阅读框和编码序列的正确性；

进一步的，融合表达步骤具体为如下步骤：

将T5核酸外切酶融合蛋白表达载体pGEX-T5核酸外切酶转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l的氨苄青霉素的LB液体培养基；待细菌长至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导T5核酸外切酶的表达；16℃诱导12个小时后收集菌体。

进一步的，纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤：