[发明专利]一种中山杉品种118的组织培养繁殖方法

权利要求书

1.一种中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于所述繁殖方法包括如下步骤：

(1)外植体选取与消毒：选取春季中山杉118带有腋芽的枝条作为外植体，进行消毒处理；

(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO₃)₂.4H₂O 228mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl₂.2H₂O，用K₂SO₄730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO₃，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化；

(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6-0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养20-25天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为50％～65％；其中，不定芽诱导培养基为：所述改良1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L+KT 300.8mg/L；

(4)高压静电场HVEF处理：利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间25分钟；

(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25-30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％；所述继代增殖培养基为：所述改良1/2MS+6-BA 4.0mg/L+IBA 0.5mg/L+ZT 0.3mg/L+GA₃0.5mg/L；

(6)生根培养：接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；其中，生根培养基为：所述改良1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L。

(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉118带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中；所述基质由体积比为2∶1∶1的泥炭土、蛭石以及珍珠岩组成。

2.根据权利要求1所述中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中外植体的消毒过程：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。

3.根据权利要求1所述中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂7g/L、蔗糖30g/L，且pH值为5.8。