[发明专利]一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法

权利要求书

1.一种制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括如下步骤，

表达载体及工程菌的构建：人工合成pro-hBDNF序列，将其序列克隆入载体得到含有pro-hBDNF的重组载体；再将其转化到大肠杆菌中，得到工程菌；

pro-rhBDNF的包涵体表达；

pro-rhBDNF包涵体的复性：pro-rhBDNF包涵体裂解、洗涤、溶解、复性；

pro-rhBDNF的分离纯化；

rhBDNF成熟肽的分离纯化：胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽；rhBDNF成熟肽的纯化。

2.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述表达载体及工程菌的构建为，人工合成SEQ ID NO:1序列，并且在序列上下游分别引入NdeI酶切位点和BamHI酶切位点；利用限制性内切酶NdeI和BamHI对含目的片段的质粒和pET11a空载体分别进行双酶切；然后将酶切产物分别用乙醇沉淀纯化；用T₄ DNA Ligase将纯化后的酶切产物和原核表达载体进行连接反应；将构建好的融合表达载体pET11a-pro-hBDNF转化到E.coli TOP10中，经菌液PCR鉴定和测序鉴定后，鉴定正确的pET-11a-pro-hBDNF的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta (DE3)或Rosetta (DE3)pLysS表达菌株中即得到工程菌。

3.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF的包涵体表达为，按1:50的比例将工程菌转接于新鲜的液体LB培养基中，37°C，250rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀≈1.0-1.2，加入IPTG至终浓度为 1mM，37°C，250rpm条件下诱导表达4h，8000 rpm，4 °C离心20 min收集菌体。

4.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF包涵体的复性为，按5 ml buffer/g菌体的比例添加Lysis buffer，重悬菌体；添加10 μg/mL DNase，3 mM MgCl₂；在冰水浴中进行超声波破碎菌体，超声波处理1 s，停止2 s，共处理10 min；加入1/2 体积的Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用Lysis buffer重悬沉淀，添加1/2体积 Triton buffer，室温振荡30 min；12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；用IB wash buffer重悬沉淀，12000 rpm 4°C离心10 min，去上清；重复洗涤包涵体3-4次；再按 5 mL/g 包涵体的比例添加溶解buffer（6M盐酸胍，100 mM DTT），室温溶解包涵体，待沉淀全部溶后，12000 rpm，4°C离心10 min，取上清；使用6 M盐酸胍溶液透析包涵体溶液，可室温透析3 h后更换透析缓冲液，于4 °C透析过夜；再缓慢添加至复性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μL；使盐酸胍终浓度降至200 mM，于4 °C中过夜；所述Lysis buffer为0.1M Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.0；Triton buffer为6% Triton X-100，1.5M NaCl，60mM EDTA；IB wash buffer为0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0；溶解buffer为6M盐酸胍，100 mM DTT；复性液为0.1M Tris-HCl, 1M L-精氨酸, 5mM EDTA, 0.61g/L 氧化型谷光氨肽, 1.53 g/L 还原型谷光氨肽。

5.权利要求1所述制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF的分离纯化为采用阳离子交换层析和疏水作用层析。