[发明专利]一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种以Pro-BDNF的形式制备人脑源性神经营养因子的方法。

背景技术

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。一种小分子二聚体蛋白质BDNF结构、分布及信号转导BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9.99,主要由β折叠和无规则卷曲二级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质。BDNF分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。BDNF不仅有可以和Trk家族这样有着强亲和力的受体(TrkA、TrkB、TrkC)结合还可以和分子量为75 kD的肿瘤坏死因子家族中的成员一神经营养素受体(P75 neurotrophin receptor)作用，发挥相应的生物学效应。目前脑源性神经营养因子对运动神经元病，周围神经病，基底神经节病，缺血性脑损伤，癫痫等疾病均有治疗效果。

基于脑源性神经营养因子在临床上的广阔应用前景，而现今的BDNF产品存在潜在的瑕疵：第一，BDNF由猪脑组织中提取的蛋白质，具有潜在的免疫原性。第二，随着需求的扩大，需要大量的合格的猪脑组织，成为大规模生产的瓶颈。因此，对重组人脑源性神经营养因子的开发迫在眉睫。近年来，已成功在不同表达系统中重组表达β-hBDNF的报道，包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞等表达系统，但仍未有研究成果应用于产业化。究其原因，其中大部分表达策略是直接将编码119aa的成熟肽基因直接进行重组表达，而没有考虑到成熟肽形成过程中，N端上游的导肽在成熟肽的表达过程中具有促进其正确折叠的作用，从而影响其产业化的进程。

通常所说的β-hBDNF是119个氨基酸成熟肽。在人体内，从编码基因到成熟肽经历下列过程：①prepro-hBDNF编码序列（744bp）翻译成prepro-hBDNF（247aa），prepro-hBDNF包括信号肽（prepeptide, aa: 1-18）、导肽（propeptide, aa: 19-131）、成熟肽（peptide, aa: 132-247）；②prepro-hBDNF在内质网上被信号肽酶水解形成pro-hBDNF，pro-hBDNF包括导肽和成熟肽。导肽末端带有4个氨基酸残基（aa: 128-131）Arg-Val-Arg-Arg，该4个氨基酸序列为哺乳动物前体蛋白加工酶（proprotein convatases）的识别位点，导肽可被高尔基体中的前体蛋白加工酶-弗林蛋白酶（furin）识别并切除，形成hBDNF(119aa)。

因此，本领域中迫切需要开发利用剔除信号肽后的pro-hBDNF（导肽+成熟肽）进行原核表达制备重组人脑源性神经营养因子的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种剔除信号肽后的pro-hBDNF（导肽+成熟肽）进行原核表达制备重组人脑源性神经营养因子的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种制备人脑源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括如下步骤，

表达载体及工程菌的构建：人工合成pro-hBDNF序列，将其序列克隆入载体得到含有pro-hBDNF的重组载体；再将其转化到大肠杆菌中，得到工程菌；

pro-rhBDNF的包涵体表达；

pro-rhBDNF包涵体的复性：pro-rhBDNF包涵体裂解、洗涤、溶解、复性；

pro-rhBDNF的分离纯化；

rhBDNF成熟肽的分离纯化：胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前导肽获得rhBDNF成熟肽；rhBDNF成熟肽的纯化。