[发明专利]用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法。

背景技术

基因重组技术是现代基因工程研究的一项基本技术，这种操作可把特定的基因整合到载体上，并使之在受体细胞中增值表达。分离纯化供体生物遗传物质，用PCR扩增方法在两端加上特定限制酶识别位点，酶切处理后与适当载体连接，形成重组分子，然后转入受体细胞中增值表达。

为了方便表达产物纯化，一般在目的蛋白之前加上特定标签，但有些蛋白的活性受标签影响较大，需要在纯化后将标签切除。SUMO蛋白酶以非常特异的方式切割重组蛋白的SUMO标签，因此含SUMO标签的表达载体应用广泛。但目前的使用方法均为在目的蛋白基因两端设计与载体相同的酶切位点，载体和目的基因分别双酶切后纯化回收，再将目的序列和载体经T4DNA连接酶连接，转入宿主细胞。操作繁琐，成本较高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于同源重组的SUMO载体的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.1所示的第一合成片段，所述第一合成片段的第439-444的6个核苷酸为限制性内切酶SfoI识别序列，第151-441的291个核苷酸为改进后的第一种SUMO标签的核苷酸序列；

(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第一合成片段，使第一合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；

(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；

(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第一种载体前体；用限制性内切酶SfoI消化第一种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。

pET表达载体优选：pET28a、pET28b或pET42a。

另一种用于同源重组的线性SUMO载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.2所示的第二合成片段，所述第二合成片段的第438-443的6个核苷酸为限制性内切酶MscI识别序列，第151-440的290个核苷酸为改进后的第二种SUMO标签的核苷酸序列；

(2)设计带有限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增第二合成片段，使第二合成片段两端带有限制性内切酶识别位点，双酶切，回收；

(3)设计带有与步骤(2)相同的限制性内切酶识别位点的引物，PCR方法扩增pET表达载体,得到两端带有限制性内切酶识别位点的T7 promoter、T7 terminator外侧的线性PCR产物，双酶切，回收；

(4)将步骤(2)和步骤(3)回收的产物连接，得到第二种载体前体；用限制性内切酶MscI消化第二种载体前体，得到用于同源重组的线性SUMO载体。

pET表达载体优选：pET28a、pET28b或pET42a。

本发明的优点：本发明可以以商品化pET系列表达载体为基础，基础载体选择面广，方便灵活，重复性强，可按照实验室现有载体情况选择限制性内切酶SfoI或限制性内切酶MscI进行酶切。以pET28a载体为例，该载体上没有限制性内切酶MscI识别序列，因此不用进行突变，将合成片段与pET表达载体PCR扩增产物连接获得质粒，用限制性内切酶MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUMO载体。

若所选载体中含有相应的限制性内切酶识别序列，首先将合成片段与pET表达载体PCR扩增产物连接获得质粒，再进行点突变，将多余限制性内切酶识别序列去除之后，用限制性内切酶SfoI或限制性内切酶MscI酶切质粒即可获得用于同源重组的线性SUMO载体。

以本发明的构建方法获得的用于同源重组的线性SUMO载体使用方便，和带有多克隆位点的SUMO环状载体相比省去了现有双酶切载体和目的蛋白核酸序列，然后回收酶切产物，再进行载体和目的片段的体外连接等步骤，本发明只需将载体及目的片段以线性的形式转入载体进行同源重组连接，方法方便快捷，不会发生载体自连现象，是表达SUMO融合蛋白的有力工具。

附图说明