[发明专利]抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法

权利要求书

1.抑制Six2基因表达的shRNA，其特征在于选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2、序列如SEQ ID NO.4所示的shSix2-4或序列如SEQ ID NO.5所示的shSix2-5中的任意一条。

2.根据权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA，其特征在于选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2。

3.一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体，其特征在于将权利要求1或2所述的抑制Six2基因表达的shRNA插入载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro的BamH I及EcoR I酶切位点所得。

4.权利要求3所述的Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA；

(2)将步骤(1)合成的shRNA进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证。

5.一种Six2基因敲除慢病毒，其特征在于由权利要求3所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

6.一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的shRNA；

(2)将合成的干扰序列shSix2-2进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证

(3)将上述成功连接干扰序列的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

7.根据权利要求6所述的Six2基因敲除慢病毒的构建方法，其特征在于步骤(3)采用含10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞，细胞密度生长至55～65％时进行病毒的转染：将权利要求3所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG，利用Lipofectamine^TM2000转染进293T细胞内；转染后的第3天收集细胞培养基，并换上新鲜的培养基；第4天再次收集细胞培养基，将两次收集的上清混匀，将上述培养基1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液利用孔径为0.45μm的PVDF滤器过滤至50ml离心管中，再次进行离心，弃去上清液得病毒沉淀。

8.一种稳定敲除Six2基因的MES23.5细胞株，其特征在于采用MOI值为10的权利要求5所述的Six2基因敲除慢病毒pLV-shSix2感染MES23.5细胞，用含有终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选得到。