[发明专利]抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抑制Six2基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

帕金森病是常见的中老年神经系统变性疾病，50岁以上人群的发病率约为1％-2％。该病的病因及发病机制仍未完全阐明，其病理变化主要表现为中脑黑质部位DA能神经元的慢性进行性丢失。GDNF对DA能神经细胞具有很好的保护作用，然而外源性给予GDNF受到难以通过血脑屏障的限制，所以，积极探索有效促进内源性GDNF的表达调控机制将对保护受损的DA能神经细胞具有很好的应用前景。

转录因子Six2是Six同源盒家族中的一员，此家族成员有三个结构域：氨基端的结构域主要参与核定位；羧基端结构域是家族成员之间差异比较大的结构域，主要介导与启动子区的结合；位于中间的同源结构域是序列比较保守的区域。研究者最初在眼的视网膜中发现Six家族成员的存在，后来发现其在肾脏等器官的发育中均起着重要的作用。Six2基因缺失或突变会导致肾脏等器官的发育不全。同时另有研究发现，GDNF也是维持肾脏正常发育所必需的因子。GDNF缺失的小鼠，出生几小时后会因肾脏发育不全而死亡。我们前期实验也发现GDNF能够很好的保护受损的多巴胺能神经细胞。GDNF维持肾脏的正常发育与保护受损DA能神经细胞一样，均需要RET受体通过PI3K-Akt信号通路来介导。在肾脏发育过程中，Six2可直接结合于GDNF启动子区促进GDNF的表达，在6-OHDA损伤早期的DA能神经细胞，Six2是否也能促进GDNF的表达至今尚未见报道。鉴于此，本发明利用分子生物学的手段构建了Six2敲减的慢病毒，并筛选出敲减Six2基因的稳定细胞株，为后续研究Six2调控GDNF的功能奠定了很好的实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供抑制Six2基因表达的shRNA。

本发明的另一目的是提供一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体及慢病毒。

本发明的又一目的是提供一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

抑制Six2基因表达的shRNA，选自序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2、序列如SEQ ID NO.4所示的shSix2-4或序列如SEQ ID NO.5所示的shSix2-5中的任意一条；优选序列如SEQ ID NO.2所示的shSix2-2。

一种Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体，将本发明所述的抑制Six2基因表达的shRNA插入载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro的BamH I及EcoR I酶切位点所得。

所述的Six2基因shRNA敲除慢病毒表达载体的构建方法，包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的抑制Six2基因表达的shRNA；

(2)将步骤(1)合成的shRNA进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoRI酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamHⅠ酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证。

一种Six2基因敲除慢病毒，由本发明所述的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。

一种Six2基因敲除慢病毒的构建方法，包含以下步骤：

(1)针对目的基因Six2设计并合成权利要求1所述的shRNA；

(2)将合成的干扰序列shSix2-2进行退火使其形成双链，同时利用BamH I及EcoR I酶切后的载体质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro用DNA连接酶进行连接反应，并转化DH5α感受态细菌；提取质粒，用BamH I及EcoR I酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证

(3)将上述成功连接干扰序列的慢病毒载体质粒和包装质粒pLP1及pLP/VSVG转染293T细胞获得慢病毒pLV-shSix2。