[发明专利]重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用，以及表达腈水解酶的重组大肠杆菌生物催化1-氰基环己基乙腈制备加巴喷丁关键中间体1-氰基环己基乙酸的方法。

(二)背景技术

加巴喷丁化学名为1-氨甲基-1-环己烷乙酸。由美国Warner-Lambert公司开发，于1993年5月首先在英国上市，1994年获得FDA批准在美国上市，后来陆续在全世界众多国家被用于癫痫病治疗，1996年，Warner-Lambert公司开始扩大加巴喷丁适应症的研究，2002年，FDA批准将其用于治疗神经病理性疼痛药。加巴喷丁除可单独用于治疗一般癫痛病外，还被作为难治性癫痫病的叠加治疗药，它具有耐受性良好，副作用轻微的优点，是人们期待的推动世界癫痫药物市场发展的药物之一。目前，加巴喷丁的专利已经到期，世界各国纷纷开展对于该产品的研究，原料药需求巨大，市场前景广阔。

目前，加巴喷丁主要通过化学法合成，合成路线较多，主要列举以下3种：

(1)以环己酮为原料，经过环合、水解制得1,1-环己基-二乙酸，然后通过缩合、氨解得到1,1-环己基-二乙酸单酰胺，经过Hofmann降解反应，产物通过萃取、离子交换层析、重结晶得到加巴喷丁纯品(WO2003002504A，2003；WO2003002517A，2003；US2004063997Al，2004)。

(2)以环已酮为原料，与乙腈经过Knoevenagel反应得烯腈，与硝基甲烷经Michael加成反应得到1-硝甲基-环己基乙腈。随后经过Pd-C催化氢化还原、水解、RaneyNi催化氢化还原得到2-氮杂-螺[4,5]-3-癸酮，其水解得到加巴喷丁盐酸盐，精制得加巴喷丁纯品(US2003009055A，2003)。

(3)由环己酮合成的1-氰基环己基乙腈为原料，在甲苯、醇溶液中，通入干燥HCl加压反应，并去除过量的HCl和溶剂，调pH，水洗，蒸除溶剂得到1-氰基环己基乙酸乙酯。1-氰基环己基乙酸乙酯在碱性条件下加热反应，以RaneyNi为催化剂进行催化加氢，冰乙酸调pH至中性，析出加巴喷丁粗品，经甲醇、水、异丙醇重结晶得加巴喷丁精品。(EP4l4262A，1991)，此方法虽然可以跳过加巴喷丁盐酸盐，省去了复杂的加巴喷丁提纯工艺，但是化学法腈水解(醇解)，反应中需要使用大量(例如：10倍量的苄醇/乙醇)的相对较贵的原料，反应条件苛刻，产生的废气须大量碱液吸收，步骤较多，收率较低。

腈水解酶能够实现有机腈化合物的一步水解合成对应的有机羧酸。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且具有比较高的区域选择性和立体选择性。近年来，利用腈水解酶进行氰基水解合成有机羧酸已经成为研究的热点，大量文献、专利报道了腈水解酶在有机羧酸合成中的应用。更重要的是，许多对于双腈具有区域选择性催化活力的腈水解酶的发现，对于阿托伐他汀侧链关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸(Junhua Tao,Org.Process.Res.Dev.2006,10,661-665)、普瑞巴林手性中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸(Zhiyi Xie,J.Mol.Catal.B-Enzym.2006,41,75-80)、加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸(US2005009157 A1)、L-甲基多巴等关键药物中间体酶法合成工艺的建立具有巨大的指导作用。因此，获得对1-氰基环己基乙腈具有高水解活性和区域选择性的腈水解酶，有利于实现加巴喷丁的大规模工业化生产。

1-氰基环己基乙酸是非常重要的医药中间体，是新一代抗癫痫来药物加巴喷丁的合成前体。区域选择性腈水解酶催化生产1-氰基环己基乙酸不仅相比传统的化学法缩短了步骤，而且绿色、高效。筛选新型生物催化剂，开发高效加巴喷丁关键中间体酶法合成工艺，建立绿色经济的加巴喷丁合成新工艺具有重要意义。Zhu等人(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)报道了来自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的腈水解酶bll6402，发现此腈水解酶可以催化各种双腈，对部分双腈具有较高的区域选择性，然而，由于较低的催化活性和底物耐受性抑制了1-氰基环己基乙酸的工业化生产。

(三)发明内容

本发明目的是解决传统的化学法水解1-氰基环己基乙腈为1-氰基环己基乙酸的工艺中，反应条件苛刻，反应中需要大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重的问题。