[发明专利]一种含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法

权利要求书

1.一种含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述方法为：将含腈水解酶基因的工程菌经扩大培养获得的种子液以体积浓度2～4％的接种量接种至发酵罐，于37℃、500rpm、通空气比1-2vvm条件下发酵培养至发酵液溶解氧15％±5％，开始采用DO-STAT方式添加补料培养基，维持发酵液溶氧值在15％±5％，调整搅拌转速为600～700rpm，发酵至OD₆₀₀达到20～40时，调整温度至25～35℃，加入终浓度10～25g/L乳糖进行第一次诱导；发酵至OD₆₀₀达到70～110后，调整转速至720～780rpm；发酵至OD₆₀₀达110-130，再次加入终浓度10～15g/L乳糖进行二次诱导；发酵至OD₆₀₀达到115～140后，调整转速至780～850rpm，继续发酵至OD₆₀₀达到150～190后，调整转速至900～1300rpm；维持发酵转速为900～1300rpm、温度25～35℃条件下，继续发酵至OD₆₀₀值以及比酶活在3h内不再上升或开始下降时，停止发酵，放罐，获得发酵液，发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～7.0；所述发酵罐内添加含终浓度50g/L卡那霉素的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～15g/L，NaCl5～15g/L，甘油5～20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3～10g/L，KH₂PO₄ 0.5～3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.0～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～1.0g/L，溶剂为水，pH值为6.0-7.0；所述补料培养基组成为：蛋白胨50-120g/L，酵母提取30～80g/L，甘油300～900g/L，柠檬酸1～8g/L，硫酸铵1～10g/L，K₂HPO₄ 1～8g/L，NaCl 1～10g/L，MgSO₄ 1～10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～7.0。

2.如权利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述维持发酵液溶氧值在15％±5％，调整搅拌转速为700rpm，发酵至OD₆₀₀达到90后，调整转速至750rpm；发酵至OD₆₀₀达125后，调整转速至800rpm，继续发酵至OD₆₀₀达到170后，调整转速至1000rpm。

3.如权利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述发酵液OD₆₀₀值达30时，加入终浓度20g/L乳糖进行诱导。

4.如权利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述诱导培养至OD₆₀₀值达120时，再次加入终浓度14g/L乳糖进行二次诱导。

5.如权利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1.36g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.28g/L，MgSO₄·7H₂O 0.375g/L，溶剂为水，pH值为6.5。

6.如权利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述补料所用培养基组成为：蛋白胨75g/L，酵母提取50g/L，甘油500g/L，柠檬酸3g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄ 3g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄ 5g/L，溶剂为水，pH值为6.5。