[发明专利]一种含腈水解酶基因工程菌的高密度发酵方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种产腈水解酶的重组大肠杆菌的高密度培养和目的基因的高效表达方法。

(二)背景技术

腈水解酶能够实现有机腈化合物的一步水解合成对应的有机羧酸。通过腈水解酶实现氰基水解反应条件温和，反应效率高，而且具有比较高的区域选择性和立体选择性。近年来，利用腈水解酶进行氰基水解合成有机羧酸已经成为研究的热点，大量文献、专利报道了腈水解酶在有机羧酸合成中的应用。更重要的是，许多对于双腈具有区域选择性催化活力的腈水解酶的发现，对于阿托伐他汀侧链关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸(Organic Process Research&Development 2006,10,661-665)、普瑞巴林手性中间体(3S)-3-氰基-5-甲基己酸(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic41,2006:75–80)、加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸(US2005009157A1)、L-甲基多巴等关键药物中间体酶法合成工艺的建立具有巨大的指导作用。

扁桃酸(mandelic acid,MA)又称作苦杏仁酸，为手性分子，两种对映异构体。光化学纯R-扁桃酸(R-MA)是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体。广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素、半合成青霉素等抗生素、抗肿瘤药物、减肥药物、农药及其他药物。此外，R-MA还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，被称为“万能”拆分剂，其中对醇胺类药物的拆分尤为突出。随着R-MA的新用途的不断发现，其市场需求也在与日俱增。

R-MA的生产技术主要有光学异构体拆分法和不对称化学合成法。其中不对称化学合成法所采用的催化剂价格昂贵、生产成本高，且所得产物的e.e.％偏低(65％-85％)，无法用于手性药物的合成。因此，目前，工业上主要以化学拆分法为主。即先合成外消旋扁桃酸，然后采用非对映体盐结晶拆分法得到具有光学活性的扁桃酸。但是，该方法的理论收率仅为50％，且所用的试剂有一定的毒性，这在一定程度上造成了资源的浪费和环境的污染。与之相比，生物催化法手性合成R-MA具有催化高效、高选择性、条件温和等优点。因此受到广泛关注。特别是以腈水解酶作为生物催化剂，不对称水解外消旋扁桃腈的方法，前景广阔，已经成为各国争相开发的酶催化技术。

加巴喷丁(Gabapentin)是一种新型抗癫痫药物，其化学名为1-氨甲基-环己基乙酸，分子式为C₁₉H₁₇NO₂。加巴喷丁是哺乳动物体中的一种重要神经递质—γ-氨基丁酸(GABA)的结构类似物，主要通过改变GABA的代谢来发挥药理作用，尤其对重症癫痫的治疗效果明显。在高剂量下耐受性良好，不与血浆蛋白结合，毒性较低，半衰期较长，副作用小。因此，自上市以来市场份额逐渐增加，目前已跃居世界畅销药前100强。

加巴喷丁分子结构简单，一个六元环的同一个碳原子上连接两个取代基。因此，多以六元环化合物为起始原料合成加巴喷丁。目前，诸多研究者以环己酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷、苯甲腈等为原料开发出了数十条合成路径。这些合成路径所使用的皆为单纯的化学方法。他们各有优劣：有些反应步骤冗长；有些反应条件苛刻。这些已报到的合成路径，多数并不适用于工业化生产。较之其他合成方法，Jennings,Rex Allen等人(EP0414262A2)于1991年报道了从1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁的方法，是一条较好的生产途径。

试剂和条件：(1)Py/TiCl₄(2)NaCN/EtOH/H₂O(3)①(g,10psi)/EtOH/PhCH₃②H2O/1mol/L/NaOH/PhCH₃(4)50％NaOH/MeOH/CH₂Cl₂,37％HCl(5)10％Rh-C/H₂(5)10％Rh-C/H₂(50psi)/MeOH/i-PrOH(6)Raney Ni(50％in H₂O)/MeOH/50％NaOH/H₂(180psi),i-PrOH/THF.