[发明专利]一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法

权利要求书

1.一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：

（1）人工合成烟草钾离子转运体HAK1的基因序列:

烟草钾离子转运体HAK1基因为基因银行登录的完整基因序列，登记号：DQ841950；在HAK1基因编码序列的5'和3'两端分别添加XbaI-BamHI和SacI酶切位点后，送公司常规合成HAK1基因序列；

（2）构建CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1：

用BamHI和SacI分别双酶切HAK1合成片段和常规的植物表达载体pBI121，把HAK1小片段回收后连接到pBI121大片段上，形成植物表达载体pBI-HAK1，从而获得CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1，冻融法转化大肠杆菌TG1菌株后保存菌种备用；

（3）转化土壤农杆菌和烟草外植体

将表达载体pBI-HAK1用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404菌株中，在含100mg·L^-1 卡那霉素和20 mg·L^-1 利福平的YEP培养基中涂布培养，用灭菌牙签挑取抗性农杆菌单菌落进行菌落PCR检测，PCR扩增目标条带为212bp，扩增引物序列为：

      P-F：5’- TTTCCTTTGCGTCAAGTCCG-3’

  P-R：5’- CAAAACTCTGTGCTGGTCCC-3’

挑取PCR阳性的抗性单菌落，在含100mg·L^-1 卡那霉素和20 mg·L^-1 利福平的YEP培养基中28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体；把烟草无菌苗的鲜嫩烟叶切成直径为0.5mm的叶盘外植体，在重悬的菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上进行暗培养，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L^-1脱菌培养基上培养，直至脱菌完全；

（4）转基因株系的分化、移栽

将脱菌完全的外植体转接到分化培养基上光照培养，光强为4000lux，14h/d；每20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待烟苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中。

2.如权利要求1所述的一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，其中：重悬培养基为在常规的MS培养基中添加100 mg·L^-1乙酰丁香酮和20 g·L^-1蔗糖；共培养基为MS培养基中添加2.0mg·L^-1 6-BA、0.2 mg·L^-1 IAA、100 mg·L^-1乙酰丁香酮和20g·L^-1蔗糖；脱菌培养基为MS培养基中添加2.0mg·L^-1 6-BA、0.2 mg·L^-1 IAA、300mg·L^-1 头孢霉素和30 g·L^-1蔗糖；分化培养基为MS培养基中添加2.0mg·L^-1 6-BA、0.2 mg·L^-1 IAA、300mg·L^-1 头孢霉素、100mg·L^-1 卡那霉素和30g·L^-1蔗糖；生根培养基为1/2浓度MS培养基中添加0.1 mg·L^-1 IAA、300 mg·L^-1头孢霉素、70mg·L^-1 卡那霉素和20 g·L^-1蔗糖。