[发明专利]一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法。

 背景技术

    烟叶糖含量是体现卷烟吸食品质的重要指标，要提高卷烟的内在品质，需将烟叶原料的糖含量控制在适宜范围之内。一般认为，烟叶水溶性总糖含量在28％以下较适宜（胡荣海，云南烟草栽培学，北京：科学出版社，2007：38-39）。但是近年来，由于气候干旱、田间大量施肥等原因，致使烟叶淀粉积累量过大，总糖含量明显高于30％，显著影响了烟叶的吸食品质。另外，烟叶总糖是产生焦油的主要源头（刘明友等，烟叶处理降低烟气污染的作用及研究，山东农业大学学报（自然科学版），2006，37（2）：163-166），含糖量高给卷烟降焦带来很大困难。卷烟工业往往采用高效截留滤嘴、高透盘纸、膨胀烟丝和对接装纸等物理方法，通过稀释烟气或吸附烟气中的有害成分达到降低单支卷烟焦油含量的目的。这些措施虽然可以使卷烟焦油量降到一定程度，但同时也导致卷烟吸味相应变淡、劲头变小（杨国荣等，卷烟减害降焦技术的研究进展，云南化工，2009,36（2）:44-47）。为此，需要选用高烟碱、低糖的烟叶来予以平衡，使烟叶配方本身的劲头大、香气足，以避免过滤稀释后的烟味过于平淡（江今朝，关于我国卷烟降焦工作的探讨，江西烟草，2001，增刊，12-15）。随着人们对吸烟与健康问题的日益关注，烟草行业已将培育低糖、高烟碱的烤烟品种作为降焦减害和发展新型卷烟的重要途径（石屹等，培育富钾烟草品种降低烟叶焦油产生量，中国烟草科学，1997,4:15-17）。

    目前，已报道通过调节田间施肥方式、打顶时间、采收期和烘烤方法，以及添加醇化酶等措施来降低烤后烟叶的糖含量，也有报道通过工业浸泡烟叶获得浓缩提取液后再喷洒烟丝来降低烟叶总糖含量的方法（郭春梅等，一种降低烟叶总糖含量的方法及其用途，专利申请号：201210118229.6），但是这些途径很难同步实现低糖和高烟碱，而通过基因工程技术来培育低糖、高烟碱烤烟种质的方法至今未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种既降低了烤后烟叶的糖含量，同时也增加了烟碱含量，有利于生产低糖高烟碱的烟叶原料，且具有周期短、成本低的低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法。

本发明的一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，包括以下步骤：

（1）人工合成烟草钾离子转运体HAK1的基因序列:

烟草钾离子转运体HAK1基因为基因银行（Genbank）登录的完整基因序列（登记号：DQ841950）；在HAK1基因编码序列（CDS）的5'和3'两端分别添加XbaI-BamHI和SacI酶切位点后，合成HAK1基因序列；

（2）构建CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1：

用BamHI和SacI分别双酶切HAK1合成片段和常规植物表达载体pBI121，把HAK1小片段回收后连接到pBI121大片段上，形成表达载体pBI-HAK1，从而获得CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1，冻融法转化大肠杆菌（Escherichia. coli ）TG1菌株后保存菌种备用；

（3）转化土壤农杆菌和烟草外植体

将表达载体pBI-HAK1用冻融法转化到土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株中，在含100mg·L^-1 卡那霉素和20 mg·L^-1 利福平的YEP培养基中涂布培养，用灭菌牙签挑取抗性农杆菌单菌落进行菌落PCR检测。PCR扩增目标条带为212bp，扩增引物序列为：

  P-F：5’- TTTCCTTTGCGTCAAGTCCG-3’

  P-R：5’- CAAAACTCTGTGCTGGTCCC-3’