[发明专利]一种1-氰基环己基乙酸的制备方法

权利要求书

1.一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)生物转化：以腈水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7.0的缓冲液或去离子水为反应介质，在35℃进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离纯化：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸铁，搅拌絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a；③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色，抽滤，获得滤液c和滤饼c；④将滤液c调节pH值为2.0～2.5，静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和滤液e，将滤饼e干燥，获得1-氰基环己基乙酸。 

2.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述催化剂的质量浓度为2.5～50g/L反应介质，底物的初始浓度为1mol/L反应介质。 

3.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述步骤②具体为：取上清液加入终浓度3～5g/L聚合硫酸铁，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1-10min，然后再在30℃、50rpm条件下搅拌5-30min，4℃下静置沉降20-60min，抽滤，获得滤液a和滤饼a。 

4.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述腈水解酶为含腈水解酶突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述含腈水解酶突变体的工程菌按如下方法获得：(1)以敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板，以序列1和序列2为引物，通过PCR方法获得含重组腈水解酶基因的克隆载体；然后再以含重组腈水解酶基因的克隆载体为模板，以序列3和序列4为引物，使用高保真的DNA聚合酶扩增目标腈水解酶基因，运用酶切连接的方法，构建了含重组腈水解酶基因的表达载体；序列1：5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，序列2：5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’， 

序列3：5’-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，序列4：5’-AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3’； 

(2)以步骤(1)构建的含重组腈水解酶基因的表达载体为模版，以序列5和序列6为引物，根据Quikchange定点突变方法，扩增得到含重组腈水解酶突变体的表达载体，并将突变表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶突变体的工程菌； 

序列5：5’-GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3’； 

序列6：5’-CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3’。 

5.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述聚合硫酸铁的加入量为3～5g/L。 

6.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述③中将滤饼a用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼b和滤液b，将滤液b和滤液a合并后加入活性炭；所述活性炭的质量加入量以滤液a和滤液b总体积计为0.001～0.01g/ml。 

7.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述④中将滤饼c用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼d和滤液d，合并滤液c和滤液d并调节pH值为2.0～2.5。