[发明专利]一种1-氰基环己基乙酸的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，特别涉及利用含重组腈水解酶的工程菌生物转化制备1-氰基环己基乙酸的方法。 

(二)背景技术

1-氰基环己基乙酸(1-cyanocyclohexaneacetic acid)是制备抗癫痫药物加巴喷丁的重要中间体。 

加巴喷丁(gabapentin)，化学名称为1-氨甲基-1-环己基乙酸，别名为卡巴番定、迭力。其结构与γ-氨基丁酸(GABA)类似，主要用于治疗癫痫及多种神经性疼痛，是一种新型的抗癫痫药物。常温下，加巴喷丁为白色或类白色结晶性粉末，无味。分子式为：C₉H₁₇NO₂。相对分子质量为171.24，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。 

加巴喷丁的分子结构比较简单，既有氨基又有羧基，易脱水形成五元环的螺环内酯，也是六元环的同一碳原子上带有两个取代基。所以，大部分研究者都以六元环化合物为起始原料。当前工业合成加巴喷丁主要通过化学方法以环己酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷等为原料经过一系列的环化、脱羧、重排、水解等反应最终制得。但是现有路线有很多的问题：(1)反应条件苛刻，需在强酸、强碱条件下反应；(2)所用原料毒性较大，操作危险，运输困难，易污染环境；(3)反应时间长，费时费力；(4)反应收率低，影响经济效益。所以现使用一条化学酶法合成加巴喷丁的路线。 

加巴喷丁的化学酶法合成路线，是以环己酮为原料，首先制得1-氰基环己基乙腈，然后再以腈水解酶催化生成1-氰基环己基乙酸，最后通过催化加氢得到加巴喷丁。整个过程操作方便、对环境友好而且收率高。而1-氰基环己基乙酸是腈水解酶法制取加巴喷丁过程中最关键的中间体。 

化学酶法具有收率高，纯度高，副产物少，易操作和环境友好等优点， 是一种较为有效的廉价生产的方法。加巴喷丁化学酶法合成路线的关键，是腈水解酶催化1-氰基环己基乙腈生成1-氰基环己基乙酸，催化完成的生物转化液中含有大量菌体，以及一些细胞破裂后流出的细胞液，蛋白质，糖类等杂质。如需进行下一步反应，需先将生物转化液中的大量蛋白质等杂质除去。 

现有对1-氰基环己基乙酸的分离提取的技术，还未见其文献报道。一般对有机羧酸的提取是通过有机溶剂的萃取，或者膜过滤装置，或者离子交换层析。 

(三)发明内容

本发明目的是提供一种1-氰基环己基乙酸的分离提取方法，可以快速、有效地将生物转化液中的蛋白质等杂质去除，并且拥有较高的收率，便于其进行下一步加氢反应。 

本发明采用的技术方案是： 

本发明提供一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，所述方法为：(1)生物转化：以腈水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7.0的缓冲液(优选PBS缓冲液)或去离子水为反应介质，在35℃进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离纯化：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸铁，搅拌絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a；③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色(优选60℃搅拌30min)，抽滤，获得滤液c和滤饼c；所述活性炭的质量加入量以滤液a体积计为0.001～0.01g/ml；④将滤液c调节pH值为2.0～2.5，静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和滤液e，将滤饼e干燥，获得1-氰基环己基乙酸。 

进一步，优选所述催化剂的质量终浓度为2.5～50g/L反应介质(纯酶浓度1g/L)，底物的初始浓度为1mol/L反应介质。 

进一步，所述步骤②具体为：取上清液加入终浓度3～5g/L聚合硫酸铁，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1-10min，使絮凝剂快速均匀分布在溶液中，然后再在30℃、50rpm条件下搅拌5-30min，使悬浮物微粒充分接触，碰撞，使絮凝物不断增大，4℃下静置沉降20-60min，抽滤，获得滤液a和滤饼a。 

进一步，所述腈水解酶为含腈水解酶突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述含腈水解酶突变体的工程菌按如下方法获得：(1)含腈水解酶的工程菌：以敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板，以序列1和序列2为引物，通过PCR方法获得含重组腈水解酶基因的克隆载体；然后再以含重组腈水解酶基因的克隆载体为模板，以序列3和序列4为引物，使用高保真的DNA聚合酶扩增目标腈水解酶基因，运用酶切连接的方法，构建了含重组腈水解酶基因的表达载体，并将表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶的工程菌；