[发明专利]金鱼心脏细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种金鱼心脏细胞系及其应用，属于医学生物技术领域。

背景技术

关于鱼类细胞系的筛选建立的研究，国内外取得了很大的研究进展。胖头鱼肌肉细胞系、剑尾鱼胚胎细胞系和巴拉圭鲹幼鱼细胞系等多种包括海淡水鱼类细胞系也陆续建立起来。2013年，国外学者建立了条纹无须魮的尾鳍细胞系和团头鲂的鳍条细胞系。2007年，国内学者樊挺俊等建立了大菱鲆鳍细胞系；2003年薛淑群等建立了鲤鱼尾鳍条细胞系。目前尚无关于建立金鱼心脏细胞系的相关报道。

世界卫生组织(OIE)推荐检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。由此，国内外的许多学者正在进行鱼类细胞系的研究。鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是制备大批量的原代细胞，从而筛选出对病毒敏感的细胞系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系(GH)，该细胞系是一些水产动物病毒的敏感细胞系，也是进一步研究未知病毒的良好材料。

本发明还要保护所述金鱼心脏细胞系的制备方法及该细胞系的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

经过筛选，本发明获得了特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系，该金鱼心脏细胞系(GH)已于2014年7月3日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No.9334，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其分类命名为金鱼心脏细胞系。

进一步地，所述金鱼心脏细胞系具有以下生物学特性：

(1)细胞呈现典型的上皮细胞形态，连续传代培养50代仍保持该形态特点；

(2)细胞具有较强的增殖能力，连续培养50代仍保持该增殖和生长特性。

本发明还提供了一种上述金鱼心脏细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取金鱼一条，用医用酒精浸泡1-5min，于无菌条件下剪取金鱼的心脏，放于浓度为1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中；

(2)用解剖刀切割成小块(约1mm)，胰酶消化液消化5min，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，再用培养基进行重悬，离心，弃掉上清，最后加入培养基，重悬混匀；

(3)将步骤(2)制备的重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，25℃培养箱中培养；

(4)待细胞铺板到1/3的时候，更换新鲜的培养基一次；

(5)待细胞铺满板子，用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养；

(6)传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为GH。

进一步地，所述培养基为含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和20﹪特级胎牛血清的M199培养基。

进一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA 0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

进一步地，本发明所述的金鱼心脏细胞系GH可以作为研究水产动物病毒宿主细胞使用，用于水产动物病毒的分离。

本发明的有益效果如下：

实验中使用的是鱼类细胞培养的最常用的培养基、且在简单的条件进行原代细胞筛选培养，保证最终获得的细胞无需特殊试剂和条件就能增殖，为其提供了广阔的应用空间。该金鱼心脏细胞系是首次成功在体外培养。该细胞在培养7天，明显出现延伸生长；15天后铺满板子，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态。细胞连续传代培养18个月已传至50代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性。因此，该细胞是一种特性稳定、成分均一的金鱼心脏细胞系，是研究水产动物病毒的良好材料。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1相差显微镜下的金鱼心脏细胞系的形态；

图2金鱼心脏细胞系悬浮特性分析；

图3金鱼心脏细胞系的最佳血清浓度的确定；

图4金鱼心脏细胞系的最佳培养温度的确定；

图5金鱼心脏细胞系的倍增曲线分析；

图6金鱼心脏细胞系的增殖病毒的初步应用。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。