[发明专利]获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞株的方法及应用

权利要求书

1. 一种获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞的方法，所述方法用于工业规模中生产治疗抗体，其特征在于，所述的方法包括五个阶段：

（1）高产稳定表达细胞株的获得；

（2）工业规模上细胞克隆产量的评价；

（3）纯化的单克隆抗体的特性分析；

（4）不同工业规模上产品特性的评价；

（5）不同发酵时间的产物产品特性的评价。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（1）中包括以下步骤：

（1）选择细胞内免疫球蛋白染色呈现单峰的细胞克隆，且平均荧光强度大于10³ ；

（2）转瓶内进一步动力学研究，选择比生产率高于3×10^-7μg /cell/h细胞克隆。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（2）包括以下步骤：

（1）在1000L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90％以上活力的活细胞浓度和最大值高于200μg /ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力；

（2）在2500L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90％以上活力的活细胞浓度和最大值高于200μg /ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（3）包括以下步骤：

（1）采用蛋白A-亲和层析和离子交换层析从发酵收获液中纯化抗体，所述抗体的平均产量为200 mg/L– 300mg/L，纯度大于95％；

（2）使用下列分析技术对参考品进行特性分析：质谱法测定氨基酸序列及翻译后修饰，质谱法检测分子量，高压液相法分析肽图图谱及糖基化组成，弱阳离子交换色谱法测定电荷异质性，表面等离子体共振法测定亲和性，分析超速离心法分析沉降系数及分子量。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（4）包括以下步骤：

（1）评价1000L和2500L发酵规模的产品样品的肽图图谱、电荷异质性和糖基化修饰；

（2）与参考品进行可比性分析，显示无显著差异。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（5）包括以下步骤：

（1）随着发酵的运行，评价不同细胞培养时期产物的分子量质谱数据、肽图谱、弱阳离子交换色谱法测定的电荷异质性、糖基化组成、分析超速离心法分析的沉降系数和分子量、表面等离子体共振法测定的亲和性；

（2）与参考品进行可比性分析，显示无显著差异。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述的骨髓瘤细胞系为NS0细胞系。

8.根据权利要求7所述的方法，所述NS0细胞系生产抗EGFR hR3抗体。

9.根据权利要求8所述的方法，选择使用NSO细胞系中稳定高表达的细胞克隆，命名为2025/M031212，所述细胞克隆2025/M031212可制备以治疗为目的的人源化单克隆抗体hR3。

10.一种人源化单克隆抗体hR3的制备方法，所述方法包括使用权利要求9所述的细胞克隆2025/M031212在不同工业规模进行灌流发酵工艺。

11.一种包含人源化单克隆抗体hR3的药物活性成分，所述药物活性成分利用权利要求10所述的方法制备。