[发明专利]基因组DNA测序文库液相杂交诱捕富集溶液及杂交方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因组DNA测序文库液相杂交诱捕富集溶液的配方及杂交方法。 

背景技术

在过去的几年中，DNA测序技术出现了一个根本性的转变，从传统的Sanger测序发展到了所谓的“下一代测序”技术(Next Generation Sequencing，NGS)。其突出特点为大规模并行测序。NGS技术允许数以百万甚至亿万的测序反应同时进行，从而达到测序通量的巨幅增长。NGS技术平台需要构建适用于大规模并行测序的片段文库。构建测序文库的过程包括将DNA片段化，随后的DNA修复和末端处理(平端或A突出端)。最后，根据具体的技术平台而选择的特异性接头连接。 

尽管与传统的Sanger测序法相比，NGS技术相关的成本大幅降低，全基因组测序仍然是成本较高的。此外，有许多应用并不需要全基因组测序，而是需要对于一个或多个样品的特定区域进行测序。因此，如果感兴趣的区域只是基因组的一部分并或者大量数目的样品需要被分析，我们常常倾向于只对测序文库的一部分特异子集进行测序，而不是对整个基因组文库进行测序，从而减少不必要的成本和劳动力。例如有效的全外显子(所有基因的编码部分)测序是目前比较主要的应用，但是针对较小的基因组或基因组区域的富集测序也被广泛应用。在靶向富集的过程中，不感兴趣的DNA片段被最大限度的去除，目标区域被从最初的全基因组测序文库中富集出来，使得后续NGS测序所产生的测序结果主要集中在感兴趣的目标区域。 

为了更好地应用NGS进行靶向测序，多个在测序前进行靶向富集的流程已经被研制出来。通常要进行多个步骤的富集以提供最终的目标测序文库。目前， 常用的靶向富集方法包括PCR扩增法(PCR amplification)，选择性环化法(selective circularization)，以及杂交诱捕法(hybrid capture)。不同的靶向富集技术具有不同的性能和易用性。每种方法的最重要的特性，反过来也反映了靶向富集的最大挑战，包括得到靶向富集测序文库所消耗的时间，获得有用的测序结果的每个靶碱基的总成本，富集的参数，包括特异性(测序结果中目标区与非目标区的比例)，覆盖率(测序深度)，在所有靶向目标区域的覆盖均匀度，方法流程的可重复性以及所需要的输入DNA的总量。 

基于PCR原理的富集顾名思义，是利用针对目标区域的PCR引物来扩增靶向序列，进而对特异性的PCR产物进行测序。这种方法通常需要许多循环的变性，退火和延伸，常造成非特异性产物和扩增的偏向性。另外，对于运行数以百计或数以千计的单重PCR反应，需要运用专用自动化设备或分区化设备(例如Fruidigm和RainDance公司的技术)。其他的选择为在一个反应中进行有限的多重PCR。因此，基于PCR的富集并不能很容易的扩大目标区域，因而多用于较小的目标区域(几千碱基至几兆范围内)。 

选择性环化法也叫分子倒位探针(MIP)。每一个用于富集的环化探针都拥有一个单链DNA寡核酸链，其两端分别含有与靶序列互补的不相连序列，并呈相反的线性顺序。探针与靶序列的特异性杂交形成了环状DNA结构。这种结构被进一步通过间隙填充和连接反应而形成封闭的环状单链DNA。针对环上的一段共有序列而进行的PCR反应会最终扩增这些靶向富集的区域而产生靶向富集的测序文库。选择性环化法的最大优点在于其高特异性，但是其最突出的缺点是针对每个目标区域的捕获均一性较差，远低于杂交捕获法。而且其成本较高，所能检测的目标区域的大小有限(几千碱基至几兆范围内)。 

杂交诱捕法是当输入DNA样品中的目标核苷酸序列与定制的与其互补的DNA探针特异性杂交时，目标DNA序列就会被物理性的捕获和分离出来。由于杂交诱捕法可以很容易的合成大量特异性DNA探针，并在一个反应体系中同时进行，而且多种DNA测序文库样品可通过连接不同编码的测序接头而混合在一起同时处理，因而杂交诱捕的方法多用于中型到大型的目标区域(1至60Mb)或较多样品。随着全外显子测序的广泛应用，杂交诱捕法被越来越多的应用起来，针对其的各种实验流程及商品化试剂也越来越多。