[发明专利]一种巢式PCR数字定量方法

权利要求书

1.一种巢式数字PCR定量方法，其特征是改进的巢式PCR及样本10倍稀释梯度分散至有限单元的数字PCR方法，包括下列步骤：在每个反应单元中预先加入矿物油,在矿物油下方加入1-5μL小体积的第一轮PCR混合液，所述混合液包括等体积的2×反应液和连续10倍稀释梯度的样本液，在第一退火温度下使用外侧引物进行第一轮扩增；随后在第一轮扩增产物中加入10-20倍于第一轮PCR体积的第二轮PCR反应液，在第二退火温度下使用内侧引物进行第二轮扩增；最后检测扩增产物，进行计数定量。

2.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其中所述第一退火温度为44^oC-48⁰C，所述第二退火温度为56^oC-60^oC。

3.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述外侧引物短于内侧引物。

4.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其特征在于所述第一轮扩增为在矿物油下方加入1-2.5μL样本和等体积的2×外侧引物PCR反应液，使用14-18个碱基的外侧引物在44^oC-48^oC的退火温度下进行的15-25个热循环的PCR扩增。

5.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法， 其特征在于所述第二轮扩增为在第一轮同一孔中加18-45μL的1×内侧引物PCR反应液,用同样吸头插入矿物油层下面加入,使用18-24个碱基的内侧引物在56^oC-60^oC的退火温度下进行的20-30个热循环的PCR扩增。

6.根椐权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法，其中所述第二轮扩增产物的检测通过如下步骤进行：在反应液中加入SYBR Green I荧光染料进行实时检测；或在第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB (0.5μg/mL)于矿物油层下面,置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。

7.根椐权利要求3所述的巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行连续梯次的10倍稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到10个反应孔/单元，进行梯次×10单元两轮巢式PCR，当一组10个PCR有7个或多于7个扩增荧光反应定为1个靶分子/孔样本,一组10个PCR有3个及少于3个扩增荧光反应定为0个靶分子/孔样本,一组10个PCR有4个-6个扩增荧光反应定为0.5个靶分子/孔样本,以1个靶分子组或0.5个靶分子组乘以样本稀释倍数推算出初始靶模板分子绝对数量。

8.根椐权利要求4所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是按照根据权利要求7的方法推算出的初始靶模板分子绝对数量，将样本一次稀释至大约0.5个靶分子/孔,加等量2×第一轮PCR反应液后分散至整个96孔板,同样两轮改良巢式d-PCR，数据进行泊松分布计数,得到高一个数量级精确度的初始靶模板分子绝对数量。

9.根椐权利要求1所述的一种巢式数字PCR定量方法，其特征是将待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至含有100-10000个反应单元的聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式数字PCR定量。

10.用于权利要求1所述的巢式数字PCR定量方法的基因检测试剂盒, 其成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dTTP，UDG酶，Taq酶及其缓冲液，外侧引物F₁/R₁，内侧引物F₂/R₂，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH₂O，矿物油。