[发明专利]一种巢式PCR数字定量方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及通过改良巢式PCR操作来消除其引物的非特异性扩增而进行样本10倍稀释梯度的数字扩增定量方法领域。

背景技术

所谓数字定量检测或数字化诊断是指确保阳性单个分子或单个以上分子均有检测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为0的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号1计数而对靶分子进行定量的方法，以便于计算机0或1模式的自动化操作，但前提必须是检测方法本身对1个分子或0分子可靠区分。然而传统的化学反应、酶免疫反应等均是检测信号强度与待测分子含量成线性比例且信号简单相加的低灵敏度检测方法，远远区分不了1个靶分子和0个靶分子的差别，所以都无法适用于数字化定量检测方法。

上世纪80年代末诞生的核酸指数扩增的PCR技术，以其2ⁿ(ⁿ为扩增循环数)放大倍数能检测低至数十乃至数个拷贝的靶分子，然而30个循环扩增的灵敏度仍不足以测出1个靶分子和0个靶分子的区别，超过30个循环扩增又带来严重的非特异性及假阳性；且这种第一代的终末/终点PCR不易定量，需要PCR后凝胶电泳来区分非特异性扩增条带。随后两步扩增的巢式PCR应用(J Med Virol,30-2:85)以超过40个循环扩增的极高灵敏度为单个靶分子检测提供了可能，1992年，Sykes等人(Biotechniques13:444)初步尝试了基于样本稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR，并首次提出了数字化定量理念，由于这类PCR系统内引物二聚体扩增和体系外气雾胶交叉污染的严重非特异性的局限而限制了其进一步发展、应用。同年，Higuchi另辟溪径，同时扩增和“闭管”荧光检测的实时荧光PCR方法，减少了PCR后处理的交叉污染，而通过扩增曲线指数期测定来对应初始模板数的相对定量，即进入指数期的扩增循环数与初始模板数呈反对数关系，但一般采用荧光染料的实时荧光PCR仍然于30个扩增循环处产生引物二聚体的非特异性扩增，从而干扰低浓度的靶分子定量。1997年，不与非特异性扩增杂交的系列探针法实时荧光PCR(BioTechniques22:130-138)显著减少了非特异性反应，尤其以水解探针Taqman方法逐步成熟而广泛应用于临床检验，已公认为第二代q-PCR定量PCR技术。但定量需要参考品标准曲线或内标校正，对有限的标本材料如单细胞低丰度基因和野生高背景下的稀少突变基因的准确定量仍存在一定的应用限制。

1999年，Vogelstein & Kinzler报导微升级96孔板的致癌突变基因ras定量PCR及首创数字(digital)PCR概念(PNAS,USA 96:9236)，d-PCR是一种基于单分子PCR方法来进行计数的第三代绝对定量PCR方法，采用分析化学领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至微反应器单元或微滴中，每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个。经过PCR热循环反应之后，扩增产物与加入的荧光探针杂交，有一个核酸分子模板的反应单元有扩增而给出荧光信号，没有模板的反应单元没有扩增而无荧光信号。根据稀释比例和反应单元体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，就可以实现起始DNA模板的绝对定量。实现数字(digital)PCR的关键：一是荧光探针特异杂交来保证无(0)模板的反应单元无荧光信号；二是dPCR装置的反应单元足够多以保证检测单元不多于一个模板，所以进一步缩微至微流控万级反应单元即纳升体积反应装置，以及近年来微滴化百万级反应单元即皮升级体积装置(Anal. Chem.2011,83:8604)的成熟而开始走向应用。由于样本靶分子含量跨度非常大，浓度低的少于10^o=1copy/ml，浓度高的大于10^1ocopies/ml，浓标本往往需要百万级反应单元即皮升体积微流控或微滴装置才能够分配每个反应单元的核酸模板数少于或等于一个，这种追求反应单元的极致会导致应用普及受限。甚至对某些过浓标本必须进行1至几个数量级预先稀释后才能使用百万级反应单元d-PCR。因此，本领域中仍然需要一种操作简便，成本低廉而又灵敏度极高的PCR检测方法。

发明内容

为了解决d-PCR非特异性局限和微流控或微滴化装置反应单元的极限。本发明提供了一种一种巢式数字PCR定量方法，在传统巢式PCR方法的基础上进行了以下改进：

1. 使用预先矿物油封闭下两步加样和两步扩增的d-PCR方法，彻底杜绝引物二聚体PD非特异性扩增；