[发明专利]实时PCR检测单核苷酸多态性的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是由于在DNA序列中的单个核苷酸突变而导致的最终核酸序列多态；一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点，有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。

目前，少量SNP位点分析最常采用的方法为TaqMan探针法，也称实时PCR测定法。针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。其中，探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当PCR的聚合扩增过程结束后，探针与模板进行退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，那么报告荧光基团的荧光信号被淬灭基团的抑制解除，从而可以检测到荧光信号增加。利用上述原理，那么在SNP检测中，使用分别与具有SNP的两个等位基因互补、且分别修饰有不同荧光基团的两个荧光探针进行PCR；根据最终测得的荧光信号的强度，便可得知核酸样品中的两个等位基因分别的含量。

但是，上述方法的准确度依赖于荧光探针与对应的等位基因之间的亲和程度的差别，即其溶解温度(Tm)的差别。由于这种差别并不是很大，也就是说，所设计的荧光探针除了与对应的目标等位基因杂交之外，也有较大的几率与突变后的另一个等位基因杂交；因此，上述方法进行SNP检测往往导致最终的检测结果存在偏差。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种不基于探针与目标核酸之间的亲和程度，而采用具有瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶结合特异性设计的引物进行实时PCR实现单核苷酸多态性准确检测的方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种实时PCR检测单核苷酸多态性的方法，PCR过程中包括的聚合酶和荧光探针如下：

所述聚合酶为具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶；

所述荧光探针的5’端修饰有第一荧光基团、3’端修饰第二荧光基团；且所述荧光探针具有与待测核酸的未突变单核苷酸多态性位点的碱基互补的对应碱基，所述对应碱基沿5’往3’方向的下一个碱基上标记有淬灭基团；

所述荧光探针的5’端至所述对应碱基的序列与待测核酸非互补。

本发明的方法设计能够形成瓣状结构的荧光探针进行特异性的荧光标记，并结合具有瓣状核酸内切酶活性的聚合酶，据所实时PCR测得的荧光的强度，即可判断核酸样本中的目标核酸的SNP位点上的碱基的类型；可准确地区分SNP位点上的不同碱基，大大地提高了进行SNP检测的准确性。

本发明还提出上述实时PCR检测单核苷酸多态性的方法在CYP2C19基因多态性CYP2C19*2型位于第5外显子G681A(rs4244285)的多态性分析中的应用。

采用本发明的第5外显子G681A(rs4244285)的多态性检测结果中，分析结果采用特异性设计的引物和形成瓣状结构的荧光探针进行实时PCR，通过荧光结果逆向推导多态性的结果，更加精确。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例荧光探针的示意图；

图2为本发明实施例荧光探针与待测核酸形成瓣状结构示意图；

图3为本发明单核苷酸多态性位点未突变的待测核酸与荧光探针结合后正向引物延伸的示意图；

图4为图3中的荧光探针被聚合酶剪切后的残基示意图；

图5为图3所示PCR过程中荧光信号的检测结果；

图6为本发明单核苷酸多态性位点发生突变的待测核酸与荧光探针结合后正向引物延伸的示意图；

图7为图6中的荧光探针被聚合酶剪切后的残基示意图；

图8为图6所示PCR过程中荧光信号的检测结果；

图9为本发明实施例中待测核酸单核苷酸多态性位点50％突变后的PCR荧光检测结果。

图10为发明实施例1中CYP2C19*2型G681A(rs4244285)SNP位点的碱基均为胞嘧啶(C)时的荧光强度曲线；