[发明专利]基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的分析方法

权利要求书

1.基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的分析方法，其特征为：首先将O-GlcNAc修饰糖蛋白质采用蛋白酶酶解生成肽段；之后，以高碘酸钠作氧化剂，对修饰的氮乙酰葡糖胺基团上的邻位羟基进行开环反应形成两个醛基基团；利用吉拉德试剂T上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使糖肽化学衍生上季铵盐基团；然后进行质谱鉴定和分析;

通过二级质谱获得肽段的碎片信息，经过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴别;

采用液质联用，对肽段进行分离后采用质谱进行样品分析；

利用碰撞诱导解离（Collision-induced dissociation，CID）模式对肽段进行二级碎裂，对于离子阱质谱，CID能量控制在30-50%；采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行糖肽的信息利用分析;

由于目前有多款通用的蛋白质组数据库搜索引擎，其具体参数设置略有不同；

因此针对该氧连接氮乙酰葡糖胺修饰参数设置中，需做出特别调整的有：1)增加可变修饰的设置，修饰分子式C₁₃H₂₂N₄O₅，修饰位点丝氨酸和苏氨酸残基；2) 增加可变修饰的设置，修饰分子式C₁₈H₃₃N₇O₅，修饰位点丝氨酸和苏氨酸残基；3) 增加可变修饰：修饰分子式C₂H₄，修饰位赖氨酸残基；4）修饰分子式C₂H₄，修饰位点肽段氮末端；搜库结果进一步处理，为增加结果的可信度，利用二级质谱图中的特征峰进行进一步筛选；对于修饰了一分子吉拉德试剂T的修饰肽段，二级谱中应包含特征峰M/z=315.16，对于修饰了两分子吉拉德试剂T的修饰肽段，二级谱中应包含特征峰M/z=214.625。

2.按照权利要求1所述的分析方法，其特征为：在对氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质变性还原烷基化后进行蛋白质酶解，获得作为酶解产物的肽段；每100μg蛋白质加入3-6 μl1 M二硫苏糖醇（DTT），50-60 ℃反应1-2 小时；之后加入8-12 μl 1 M 碘乙酸（IAA），避光反应10-30 分钟；将处理后的蛋白质样品利用碳酸氢铵缓冲液稀释，pH值控制7.5-8.5之间，每100μg蛋白质加入2-5 μg蛋白酶进行酶解，36-38 ℃反应16-24小时；酶解肽段利用反相液相色谱除去碳酸氢铵等小分子盐，冷冻干燥后获得的肽段样品进行甲醛二甲基化方法封闭N末端氨基。

3.按照权利要求1或2所述的分析方法，其特征为：为避免肽段N末端是丝氨酸或苏氨酸残基时存在的副反应，采用甲醛二甲基化方法封闭N末端氨基，每100 μg肽段加入质量浓度3-5%甲醛溶液10-25μl，0.5-0.8 mM氰基硼氢化钠 10-25μl，反应0.5-2小时，反相除盐去除甲醛和氰基硼氢化钠；之后糖肽与高碘酸钠反应，对修饰的氮乙酰葡糖胺基团上的邻位羟基进行开环反应形成两个醛基基团；对于过量的高碘酸钠，采用亚硫酸钠作还原剂终止反应；之后加入吉拉德试剂T与新生成的醛基反应，过量的吉拉德试剂T利用反相液相色谱分离除去。

4.按照权利要求1所述的分析方法，其特征为：与氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖肽反应的高碘酸钠溶液浓度为20-30 mM；反应温度35-40 ℃，反应时间4-8小时；氧化反应结束后，加入4-6倍于高碘酸钠摩尔量的亚硫酸钠，反应10-40 分钟，终止氧化反应；整个过程在pH=5-6的乙酸钠溶液中进行；将经过高碘酸钠氧化的糖肽与浓度为10 -100 mM的吉拉德试剂混合，反应1-6小时；反应过程在pH=5-6的乙酸钠溶液中进行；采用反相液相色谱分离除去未反应吉拉德试剂。