[发明专利]基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的分析方法

说明书

本发明涉及一种基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺(O‑GlcNAc)修饰糖蛋白质分析方法。所述的O‑GlcNAc修饰糖蛋白质蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸钠氧化，修饰基团氮乙酰葡糖胺上的对位羟基进行开环反应形成两个醛基基团，利用吉拉德试剂T(Girard Reagent T)上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使O‑GlcNAc修饰糖肽的化学衍生上季铵盐基团。季铵盐基团的存在能够有效地增强肽段的质谱响应信号，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修饰基团，进行后续质谱，通过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴定。

技术领域

一种基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰糖蛋白质分析方法。所述的O-GlcNAc修饰糖蛋白质蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸钠氧化，修饰基团氮乙酰葡糖胺上的对位羟基进行开环反应形成两个醛基基团，利用吉拉德试剂T(Girard Reagent T)上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使O-GlcNAc修饰糖肽的化学衍生上季铵盐基团。季铵盐基团的存在能够有效地增强肽段的质谱响应信号，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修饰基团，进行后续质谱，通过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴定。

背景技术

氧连接氮乙酰葡糖胺修饰是一种发生在蛋白质丝氨酸及苏氨酸残基上的翻译后修饰，是一种真核细胞内重要的单糖翻译后修饰，在细胞内信号通路中扮演重要作用。然而，该种翻译后修饰的糖蛋白糖蛋白质的研究存在诸多难点：丰度低、糖肽占总肽段比例小，质谱信号响应低，没有将修饰基团切除的特异性试剂等。

文献报道中对该种糖蛋白质常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素亲和法。另外最近有文献(Journal of Proteome Research 2010,9,2200–2206)报道了一种利用高碘酸钠氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用酰阱凝胶富集研究该种糖蛋白的工作，该工作开发了利用化学手段研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的手段，相较昂贵的酶促衍生手段，为廉价大规模研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质提供可能。

氧连接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)的修饰会抑制蛋白及肽的质谱响应信号，因此增强该糖肽的质谱响应信号对其基于质谱的分析鉴定将有极大的帮助。在蛋白质或肽段上衍生上季铵盐基团在增强样品质谱信号，改变样品电荷等方面有着广泛的应用。因此，我们通过季铵盐基团的修饰能有效地提高质谱信号，为后续的质谱分析研究提供帮助。

氧连接糖肽的二级质谱碎裂中，在CID碎裂模式下，碰撞碎裂能量往往集中于糖链的碎裂，无法获得较好的肽段碎裂信息。本方法中，在对修饰的氮乙酰葡糖胺基团进行了吉拉德试剂T的化学衍生，使其修饰的肽段在CID碎裂模式下能够得到较好的碎片信息。同时该方法也保留了部分氮乙酰葡糖胺基团的结构信息，利用二级质谱谱图的特征峰离子可有效提高谱图分析的可信度。

发明内容

衍生上季铵盐基团能够增强样品质谱信号，同时该化学衍生有利于肽段获得较好的CID二级碎裂，为后续数据库搜索获得良好的肽段鉴定结果提供帮助。本发明的目的是提供一种对氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽的质谱分析方法，该方法通过对该糖基化修饰的化学衍生提高了糖肽质谱信号，并能够获得良好的二级质谱碎片信息。使后续的数据库搜索能够更好地鉴定氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

O-GlcNAc修饰糖蛋白质蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸钠氧化，修饰基团氮乙酰葡糖胺上的对位羟基进行开环反应形成两个醛基基团，利用吉拉德试剂T(GirardReagent T)上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使O-GlcNAc修饰糖肽的化学衍生上季铵盐基团。季铵盐基团的存在能够有效地增强肽段的质谱响应信号，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修饰基团，进行后续质谱，通过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴定。

所述氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质质谱分析方法，具体步骤如下：