[发明专利]一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针

说明书

技术领域

 本发明属于生物学研究中高性能探针，特别是一种以三联吡啶为骨架含苯砜基的顺磁荧光双功能探针。

背景技术

蛋白质的分子结构是其生物功能的基础，因此，研究蛋白质的分子结构和动态变化将有助于我们更深入的了解蛋白质如何行使其功能。X射线晶体衍射和高 分辨核磁共振是目前获得高分辨率蛋白质结构的两种主要技术手段，而相对于X射线晶体衍射，核磁共振、荧光光谱和电子自旋共振在研究蛋白质动态学方面具有非常重要的作用。另外，核磁共振可以在溶液中研究生物大分子的空间结构和功能之间的关系，并且测定条件更加接近生理条件，可不破坏生物大分子的结构，得到的结果更加接近实际。

蛋白质的化学修饰提供了研究其功能和动态变化的新技术，这种技术可以广泛应用到核磁共振、电子顺磁共振和荧光光谱的研究中，借助小分子基团及其金属配合物的磁学性质和光谱特性，可以获得大分子蛋白质的动态行为、结构变化和作用机制。但是化学修饰蛋白质需要强调位点单一并且刚性的问题是目前顺磁技术和荧光能量共振转移研究中亟需解决的问题，另外蛋白质-探针链接的稳定性也是研究中的关键问题。

生物大分子与顺磁探针定点连接以后，由于顺磁效应，顺磁中心附近的氨基酸残基的化学环境会产生较大的变化，导致其核磁共振谱峰的化学位移产生明显变化。人们就可以借助采集PCS、PRE或RDC等顺磁数据来研究生物大分子的结构、功能以及生物大分子之间的相互作用，参见：J. Biomol. NMR, 2010, 46: 101-112。

Nguyen等人，参见Angew. Chem. Int. Ed.2011, 50, 692–694，将非天然氨基酸类化合物，如图1中化合物L-1，引入NS2B-NS3蛋白酶中，分别取代NS3中的Q86， H87和 K88，他们发现只有在H87BpyAla突变体中滴加Co²⁺，才有明显的PCS，Q86BpyAla，K88BpyAla突变体滴加Co²⁺只有PRE，这说明在这两个位点，顺磁标签的柔性比较大。但由于L-1只能和过渡金属离子配位，而在过渡金属离子中也只有Co²⁺等少数金属离子才能测得明显的PCS，可得数据较少，所以在一定程度上限制了L-1的应用。

Stephan Grzesiek等人，参见J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14761–14767，报道了镧系金属离子螯合探针DOTA-M8，由于其骨架及臂上都增加了手性诱导基团，克服了如图1中化合物L-2等DOTA类似物骨架和臂的震动，参见Inorg. Chem.2003, 42, 2342?2349，使其与镧系金属离子的螯合物具有单一构象，从而使DOTA-M8成为一个有效的通过顺磁标记来研究生物分子的结构与功能的探针。

Su等人，参见Chem. Eur. J. 2013, 19, 1097-1103，报道了化合物4VPyMTA，即图1中化合物L-3，它的体积小，与镧系金属离子有很强的结合能力，并且与镧系金属离子结合后具有单一的构象，能够与蛋白表面选择性连接，而且连接后的产物非常稳定，可在原位分析蛋白的结构。

利用荧光探针与生物分子相互作用前后光谱信号的变化，人们可以在不破坏生物分子结构与功能的条件下对生物分子的结构和生物过程进行定性及定量的研究。因此，荧光测定术作为一种目前发展比较成熟的技术，其在生物体系研究领域也有着很好的应用前景。虽然传统的有机荧光探针具有合成简单，荧光量子产率较高和易于进入细胞等优点，却因为它们水溶性差、Stokes位移较小、荧光寿命短以及容易被荧光背景干扰等缺陷限制了它们在生物体系中的应用。而镧系荧光探针具有水溶性好、Stokes位移大、荧光寿命长以及谱峰窄等诸多优势，因而可以排除生理环境中荧光背景的干扰，提高测定分析灵敏度，从而弥补了传统有机荧光探针的不足。

Barbara Imperiali等人，参见J. Am. Chem. Soc.2006, 128, 7346-7352，报道了一种可用来研究蛋白质-蛋白质相互作用的含有15-20个天然氨基酸并结合有金属离子Tb(Ⅲ)的多肽探针。借助荧光共振能量转移等手段，他们通过应用此探针来监测SH2区域和不同磷酸肽之间的相互作用以及测量蛋白质-多肽的离解常数。但此探针的合成需借助固相合成的手段，合成难度较大。