[发明专利]不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒。

背景技术

临床上尿素(Urea)用于诊断肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎、前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。

尿素的测定方法包括：化学法、脲酶一波氏法等。化学法又可分为：(1)二乙酰一肟显色法，原理为：尿素可与二乙酰作用，在强酸加热条件下，生成粉红色的二嗪化合物，在540nm比色，因二乙酰不稳定，常用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。此法专一性差，线性范围狭窄，且试剂中含有烈性化学物，易腐蚀仪器和污染环境。(2)邻苯二甲醛比色法：尿素在强酸性环境下，与邻苯二甲醛缩合产生橙红色产物，比色测定之。(3)二苯吡喃醇比浊法：尿素与二苯吡喃醇结合形成不溶性沉淀，比色测定之。采用化学法检测尿素，特异性均不高，如瓜氨酸对二乙酰反应有正干扰；甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸及磺胺类药物对邻苯二甲醛反应有正干扰。加之要用强酸或强碱环境，或需要较高温度(90℃)反应，较难实现自动化，故这类方法己经较少使用。脲酶一波氏法：测定原理：首先用脲酶水解尿素，产生2分子氨和1分子二氧化碳。然后，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸反应，生成蓝色的吲哚酚，此过程需用亚硝基氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长比色测定。此法的不足在于空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法通过在同一条件下测定空白管、标准管和测定管在340nm处吸光度的下降速率，即可计算出样品中尿素的含量。但是该方法受样本内源性氨的干扰严重，试剂稳定性差。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒。用本发明的测试试剂盒来检测血清中的Urea含量，可达到操作简便、稳定性佳、抗干扰能力强，快速、测定结果准确可靠的目的。

本发明测定Urea含量的原理为：尿素在尿素酶(Urease)的催化下，水解生成氨和二氧化碳，氨在α-酮戊二酸和还原型辅酶I(NADH)存在下，经谷氨酸脱氢酶(GLDH)催化，生成谷氨酸，同时NADH被氧化成NAD+，引起340nm波长处吸光度的下降；吸光度的下降与血清中尿素的浓度成正比，通过监测340nm波长处吸光度的变化，可测定血清中尿素的浓度。

特别的，本发明在R1试剂中加入了谷氨酸脱氢酶和NADH，消除内源性氨的干扰，以提高试剂的抗干扰能力。

即在没有加入R2之前，样本中的内源性氨先和试剂R1进行反应，用来消除内源性氨的干扰，反应方程式为：

接着加入R2后再进行如下反应：

同时，本明在试剂R2中加入了酶保护剂，极大地提高了试剂的稳定性。实验表明，加入酶保护剂的试剂酶活性远远优于不加酶稳定剂的试剂。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；所述试剂R1含有1～500mmol/L pH＝3.0～8.0的缓冲液、1～80KU/L谷氨酸脱氢酶、0.5～2KU/L还原性辅酶I(NADH)、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、1‰～5‰(即：表面活性剂占R1总重的重量百分比含量)表面活性剂和0.1～1g/L防腐剂；所述试剂R2含有1～500mmol/L pH＝3.0～8.0的缓冲液、1～60KU/L尿素酶、0.5～2KU/LNADH、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、10～500mmol/L氯化钠、1～50mmol/L酶保护剂和0.1～1g/L防腐剂。

优选的，所述试剂R1含有100～300mmol/L pH＝5.0～8.0的缓冲液、20～60KU/L谷氨酸脱氢酶、1～1.5KU/L NADH、50～100mmol/Lα-酮戊二酸、1‰～5‰表面活性剂和0.2～0.8g/L防腐剂；所述试剂R2含有100～300mmol/L pH＝5.0～8.0的缓冲液、10～30KU/L尿素酶、1～1.5KU/L NADH、50～100mmol/Lα-酮戊二酸、100～300mmol/L氯化钠、10～40mmol/L酶保护剂和0.2～0.8g/L防腐剂。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、丙磺酸(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或BICN。