[发明专利]一种葡萄果皮RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡萄果皮RNA的提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

能否提取出高质量的RNA是果树分子生物学与功能基因组学研究的关键基础工作之一，如RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等都需要高质量的RNA。近年来发展的高通量测序技术和高性能的生物信息分析技术对于RNA的质量要求极高，这使得RNA提取在完整性和纯度方面有了更高的要求。由于RNA酶活性强，故要得到无降解RNA难度比较大。植物细胞具有坚硬的细胞壁，细胞内有较大的液泡及内含物，以及与核酸极性接近的多糖、多酚及其它次生代谢物，使得植物材料RNA的提取难度高于动物材料。

葡萄浆果发育及成熟机制，果皮花青苷含量调控机制的研究是目前葡萄分子生物学研究的重点之一，但是其组织中RNA提取一直是难点。由于葡萄果皮中多糖多酚物质含量较高，其一些理化性质与RNA相似，在去除多糖多酚操作的同时RNA也容易被裹带走，现有的适用于叶片、花等组织中RNA的提取方法，不适用于葡萄浆果，在实际操作过程中很难将它们分开，造成RNA产量的减少。这些问题直接影响到RNA的生物信息分析研究，也很难满足进一步分子生物学研究的需要。

本发明总结出一种适合于葡萄果皮RNA提取的最优方法，能达到提取效率高，RNA纯度高，降解少的目的，有利于进一步的基因表达研究和高性能的生物信息分析技术。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种成本较低、效率较高的葡萄果皮RNA的提取方法。

本发明一种葡萄果皮的提取方法包括如下步骤：

(1)将待用的CTAB裂解液放置在65-70℃水浴中预热10min。

(2)取0.2g葡萄果皮，在研钵中用液氮研磨成粉末状后，盛入2ml离心管内。

(3)吸取1ml预热过的CTAB裂解液到2ml离心管内，加入20μLβ-巯基乙醇，缓慢震荡混匀后，放回到65-70℃水浴中，水浴45-50min，期间反复颠倒混匀2-3次。

(4)水浴完成后，将上述样品液加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，12000rpm，4℃离心10min。

(5)吸取一定量上清液至新的2ml离心管内。重复步骤(4)抽提二次。

(6)吸取一定量上清液至一新的1.5ml离心管中，加入-20℃预冷的LiCl溶液，-20℃下沉淀过夜。

(7)4℃，12000rpm离心20-30min，弃上清，用500μl70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12000rpm离心30s。

(8)用500μl100％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心30s。

(9)吸干残留上清，干燥15min后，用30μlDEPC水溶解RNA。

所用CTAB裂解液需要提前在65-70℃水浴中预热10min，CTAB提取液的组成成分为0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA-Na₂，1.4mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)；

所用的研钵、镊子、研棒均需在40-60℃下处理3h以上，所用的1.5ml和2ml离心管均需经过DEPC水浸泡处理。

裂解液裂解材料时加入β-巯基乙醇20μL，然后放回65-70℃水浴30-45min，能够提高杂质去除效果。

萃取液为氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇＝24：1(V/V)，能够有效的去除提取液中的多糖多酚；

沉淀剂为-20℃预冷的LiCl，加入体积为吸取上清液体积的1/3，能够在保证RNA总量的前提下不损失5S RNA。

附图说明

图1为本发明不同RNA提取方法的琼脂糖凝胶电泳比较结果图。

其中A为改良CTAB法，B为改良SDS法，C为本发明。

具体实施方式

实施例1 本发明葡萄果皮RNA的提取方法

试剂准备