[发明专利]一种食品中副溶血弧菌的检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种食品中副溶血弧菌荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括培养基、检测液，其特征在于，所述的培养基为含有2％氯化钠结晶紫增菌液的嗜盐菌选择性琼脂培养基，所述的检测液由以下含量的组分制成：

2.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的表面活性剂选自吐温20、吐温40、甜菜碱中的一种或多种，所述的吐温20、吐温40、甜菜碱的体积比为(2-5)∶(1-8)∶(2-6)，所述的表面活性剂浓度为5-10mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的碱溶液选自NaOH、KOH中的一种或多种，优选的，所述的NaOH、KOH体积比为(2-6)∶(3-5)，所述的碱溶液的浓度为1-1.8mg/ml

或所述的酸溶液选自HCL、H2SO4中的一种或多种，优选的，所述的HCL、H2SO4的体积比为(2-5)∶(1-8)，所述的酸溶液的浓度为2-3mg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA提取液为0.5-0.8mmol/L的Tris-HCl。

5.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的BstDNA聚合酶浓度为0.35-0.4U/ul。

6.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的10×反应缓冲液为20-50mlTris-HCl、6-10ml0.2-0.5mg/mlKCl、6-10ml1.8-3.5mg/mlNH4SO4、10-15ml2.8-5.5mg/mlMgSO4的混合液。

7.根据权利要求1所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物由FAM标记5’，TRAMA标记3’，上游：5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3；下游：5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3。

8.一种采用如权利要求1-7所述的检测试剂盒对食品中副溶血弧菌进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细菌培养：在培养基中加入增菌液5-10ml，氯化钠0.5-2g，蛋白胨3-6g，取样，对样品进行预处理后，置培养基中培养，培养温度为35-37℃，培养时间为6-12h；并设已知无副溶血菌感染的食品样品为空白对照组；

(2)将步骤(1)中培养后的可疑菌落取出，加入无菌生理盐水，并加入无菌酸试剂或碱试剂，制成PH＝8.4-8.8的菌悬液；

(3)将步骤(2)中制得的菌悬液离心5-8min，弃上清，加入DNA提取液80-100ml，加入叠氮溴化乙锭10-20ml，混匀加热，加热温度为90-95℃，加热时间为5-10min，离心，弃上清，得样品待测液；

(4)将步骤(4)中制得的样品待测液加入5-10至PCR管中，于63℃恒温水浴箱内进行恒温扩增反应，反应时间为60-90min；

(5)在步骤(4)中的反应产物中加入SYBRGreenI荧光染料，观察颜色，阳性：绿色，阴性：橙红色；对阳性者进行荧光定量PCR检测，具体方法为：93℃预变性3min，55℃变性30s，40个循环，1min退火及延伸，读荧光值。

9.根据权利要求7所述的一种检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的取样及对样品进行预处理具体方法为：固体样品取样10-20mg，用均质器打碎，液体样品取样3-8ml，充分摇匀。

10.根据权利要求7所述的一种检测方法，其特征在于，步骤(5)中PCR荧光检测的荧光激发波长为485-500nm，检测波长为525nm。