[发明专利]一种食品中副溶血弧菌的检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种食品中副溶血弧菌的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

副溶血弧菌是一种革兰阴性多形态杆菌，在自然界中分布广泛，海产品如海哲、黄泥螺及蟹类等其携带率最高，此外蛋类、新鲜蔬果及肉制品中也较常见。当人们直接或间接食用含有该菌的食物后，可引起肠道疾病，如腹泻、胃肠炎，此外，还可引起其他系统疾病，如关节炎及心脏疾病。副溶血弧菌是目前细菌性食物中毒中最主要的病原菌，给人类健康造成极大的危胁，对水产养殖业造成了巨大的经济损伤。

副溶血弧菌传统的鉴定与检测方法包括镜检、生化鉴定、嗜盐性试验、免疫色谱法及DNA杂交法等，但均存在各自不足之处，如镜检、生化鉴定、嗜盐性试验操作复杂、检测时间长，且灵敏度低，而免疫色谱法及DNA杂交法对设备要求高，而检测过程易受污染物影响。本发明提供一种荧光定量PCR检测方法，对食品中副溶血弧菌进行检测时，特异性强、敏感性高，操作简便，检测迅速，可避免常规PCR检测方法产生的一系列问题，

发明内容

本发明针对上述现在技术的缺陷，提供一种操作简便、准确率高、检测成本低、无污染、假阳性率低的检测试剂盒及检测方法。

一种食品中副溶血弧菌荧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括培养基及检测液，所述的培养基为含有2％氯化钠结晶紫增菌液的嗜盐菌选择性琼脂培养基，所述的检测液由以下含量的组分制成：

优选的，所述的表面活性剂选自吐温20、吐温40、甜菜碱中的一种或多种，所述的表面活性剂浓度为5-10mg/ml。

优选的，所述的碱溶液选自NaOH、KOH中的一种或多种，浓度为1-1.8mg/ml，优选的，所述的NaOH、KOH体积比为(2-6)∶(3-5)，；所述的酸溶液选自HCL、H2SO4中的一种或多种，所述的HCL、H2SO4的体积比为(2-5)∶(1-8)，浓度为2-3mg/ml。

优选的，所述的DNA提取液为0.5-0.8mmol/L的Tris-HCl。

优选的，所述的BstDNA聚合酶浓度为0.35-0.4U/

所述的10×反应缓冲液为20-50mlTris-HCl、6-10ml0.2-0.5mg/mlKCl、6-10ml1.8-3.5mg/mlNH4SO4、10-15ml2.8-5.5mg/mlMgSO4的混合液。

所述的PCR引物由FAM标记5’，TRAMA标记3’，上游：5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3；下游：5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3；

一种采用如上所述的检测试剂盒对食品中副溶血弧菌进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)细菌培养：在培养基中加入增菌液5-10ml，氯化钠0.5-2g，蛋白胨3-6g，固体样品取样10-20mg，用均质器打碎，液体样品取样3-8ml，充分摇匀，对样品进行预处理后，置培养基中培养，培养温度为35-37℃，培养时间为6-12h；并设已知无副溶血菌感染的食品样品为空白对照组；

(2)将步骤(1)中培养后的可疑菌落取出，加入无菌生理盐水，并加入无菌酸试剂或碱试剂，制成PH＝8.4-8.8的菌悬液；

(3)将步骤(2)中制得的菌悬液离心5-8min，弃上清，加入DNA提取液80-100ml，加入叠氮溴化乙锭10-20ml，混匀加热，加热温度为90-95℃，加热时间为5-10min，离心，弃上清，得样品待测液；

(4)将步骤(4)中制得的样品待测液加入5-10至PCR管中，于63℃恒温水浴箱内进行恒温扩增反应，反应时间为60-90min；

(5)在步骤(4)中的反应产物中加入SYBRGreenI荧光染料，观察颜色，阳性：绿色，阴性：橙红色；对阳性者进行荧光定量PCR检测，具体方法为：93℃预变性3min，55℃变性30s，40个循环，1min退火及延伸，读荧光值，荧光激发波长为485-500nm，检测波长为525nm。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明整个操作过程均在密封单管内完成，避免了常规PCR检测时扩增产物污染，同时本发明还设立了空白对照组，使检测结果更易判断，提高了检测结果的准确性。

2.本发明所需仪器简单，操作简便，经常规PCR仪进行循环，经国产微量荧光检测仪测荧光值，经简单计算即可得出检测结果，在我国基层医院及偏远地区均可推广使用，且其特异性比传统方法及常规PCR法明显升高。