[发明专利]从胎盘中分离提取造血干细胞的方法

权利要求书

1.从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)胎盘的收集、 

(2)胎盘的初检、 

(3)胎盘的预消毒、 

(4)胎盘及母血检测、 

(5)胎盘造血干细胞的灌洗、 

(6)造血干细胞的浓缩纯化。 

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)至步骤(4)具体为： 

(1)胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10℃，24小时内送达实验室； 

(2)胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样； 

(3)胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况； 

(4)胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)。 

3.根据权利要求1-2的方法，其中步骤(5)胎盘造血干细胞的灌洗： 

将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液。 

4.根据权利要求1-3的方法，其中步骤(6)造血干细胞的浓缩纯化： 

将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1-1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1-1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1-1：2的比例加生理盐水混匀，1200-1500rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉 上清液，加入10-20mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。 

5.根据权利要求1-4的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为： 

开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液； 

关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。 

6.根据权利要求1-5的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为： 

开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液； 

关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。