[发明专利]检测蛋白质赖氨酸-3-羟基丁酰化的方法和试剂

说明书

这项工作由美国国家卫生研究院资助，资助编号为CA126832。美国享有本发明的一定权力。

本发明的领域

本发明涉及蛋白质翻译后修饰检测试剂与方法。更具体来说，本发明涉及利用含赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的多肽开发检测蛋白质赖氨酸3-羟基丁酰化修饰的相关试剂与方法。

本发明的科学背景

越来越多的研究表明细胞内代谢与染色体结构和表观编程有关。调控组蛋白翻译后修饰(PTMs)，或者说组蛋白标记的酶可利用高能辅助底物，如乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸来促进蛋白翻译后修饰反应。这些辅酶在胞内的浓度随着胞外环境的改变而相应改变，反过来影响组蛋白标记的状态。而且，组蛋白翻译后修饰相关酶的活性受胞内代谢产物如NAD和2-羟基戊二酸的调控。

组蛋白翻译后修饰，如赖氨酸乙酰化，在其他类型蛋白中也大量存在，并且具有多种非依赖DNA的功能，包括作用于代谢的功能。近几年来，新的组蛋白翻译后修饰不断被发现，而且细胞的代谢也被发现愈加高度复杂，这些研究表明细胞内可能还存在由代谢信号调控的未知的组蛋白翻译后修饰和通路。

3-羟基酸属于酮类物质，是组织饥饿时重要的能量来源。其可调控基因表达，在很多慢性神经疾病中起神经保护的作用，然而这些功能的分子机制仍不清楚。

目前急需建立组蛋白和非组蛋白中与不同疾病有关的翻译后修饰的检测方法并开发相应的检测试剂。

本发明总结

本发明利用含3-羟基丁酰化赖氨酸的多肽开发检测3-羟基丁酰化修饰蛋白的试剂和方法，尤其是检测赖氨酸3-羟基丁基位点特异性的试剂和方法。

本发明提供一种分离的含赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的多肽。分离的多肽衍生自组蛋白或组蛋白片段。组蛋白可衍生自人，小鼠，果蝇，线虫和酵母的某一组织。分离的多肽其氨基酸序列与种属中序列编号为29-99的某一段氨基酸序列至少有70％的同源性。分离的多肽其序列可选自序列编号为29-99的某一段。分离的多肽中3-羟基丁酰化赖氨酸的N-端与C-端各至少各含两个氨基酸。

本发明也提供一种分离的赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。这种试剂可与含赖氨酸3-羟基丁酰化修饰的多肽特异性结合。多肽的氨基酸序列选自序列编号29-99中的一段。此亲和试剂与多肽的结合依赖于多肽中是否含3-羟基丁酰化修饰的赖氨酸，与赖氨酸周边序列无关。此亲和试剂与多肽的结合依赖于多肽中是否含3-羟基丁酰化修饰的赖氨酸及赖氨酸周边的序列。此赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂可能是一种蛋白质，也可以是抗体。

本发明提供赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和蛋白试剂的生产方法。此方法包括利用多肽筛选蛋白库。多肽中包含3-羟基丁酰化赖氨酸，并且其氨基与羧基端各至少含两个氨基酸。蛋白库是噬菌体展示库，酵母展示库，细菌展示库和核糖体展示库中的一种。

本发明提供赖氨-3-羟基丁酰化特异性亲和抗体试剂的生产方法。此方法包括用多肽免疫宿主动物。多肽中包含3-羟基丁酰化赖氨酸，并且其N-端与C-端各至少各含两个氨基酸。

本发明提供检测蛋白或蛋白片段中3-羟基丁酰化修饰赖氨酸的方法。此方法将蛋白或蛋白片段与分离的可特异性结合含3-羟基丁酰化修饰赖氨酸多肽的赖氨-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂反应。赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂与蛋白或蛋白片段形成反应复合物，检测此反应复合物是否形成即可检测蛋白或蛋白片段中是否含3-羟基丁酰化修饰赖氨酸。此方法用到的赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂可以是蛋白或抗体。

本发明提供确定样品中含3-羟基丁酰化赖氨酸的蛋白含量的方法。此方法包括检测样品中的3-羟基丁酰化赖氨酸的方法。

本发明提供检测蛋白或蛋白片段中3-羟基丁酰化赖氨酸的试剂盒。试剂盒中包含分离的可特异性结合含3-羟基酰化修饰赖氨酸的多肽的赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。

本发明提供分离含3-羟基酰化修饰赖氨酸多肽的试剂盒。试剂盒中包含分离的可特异性结合含3-羟基酰化修饰赖氨酸的多肽的赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。

附图的简要描述