[发明专利]一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

权利要求书

1.一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是对甘露聚糖肽进行酸解、衍生化获得甘露糖单体，再将甘露糖单体进行衍生化，通过气相色谱检测甘露糖含量，进而表征甘露聚糖肽的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸解是将甘露聚糖肽用1-2M H₂SO₄于105℃进行酸解反应，反应结束后用BaCO₃分次加入中和，振荡、离心取上清液，加入肌醇内标、混匀，进行冷冻干燥。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘露聚糖肽经过粗纯化，去除分子量小于10KD及大于100KD的杂质。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖单体的衍生化，是称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将甘露聚糖肽酸解产物的冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱检测甘露糖含量的气相色谱条件是：

色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

检测器：氢火焰离子鉴定器；

气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

载气压力：0.60kg/cm²，载气为N₂；

燃气压力：0.65kg/cm²，燃气为H₂；

助燃气压力：0.50kg/cm²，助燃气为空气；

分流比为30∶1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的测定步骤为：

(1)发酵产物的粗提纯：量取发酵液20-30mL于50mL离心管中，10000rpm离心20min，去沉淀取上清液，转至100KD超滤管，5000g离心20min，收集流出液，再加5mL去离子水至100KD超滤管，5000g离心20min，重复一次，合并流出液；将流出液转移至10KD超滤管中，7500g离心20min，截留液转移至新离心管，用去离子水多次冲洗10KD超滤管，合并截留液，将截留液进行冷冻干燥；

(2)甘露聚糖肽的酸解：称取20mg冻干物于15mL离心管中，加2mL1M H₂SO₄于105℃反应8h，反应后每管添加1mL1mg/mL的肌醇内标，混匀，称取2g BaCO₃分两次加入中和，振荡，12000rpm离心20min，取上清液于新1.5mL离心管中，进行冷冻干燥；

(3)酸解样品的衍生化：称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min，冷却后进行气相色谱分析；

(4)气相色谱条件：

色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

检测器：氢火焰离子鉴定器；

气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

载气压力：0.60kg/cm²，载气为N₂；

燃气压力：0.65kg/cm²，燃气为H₂；

助燃气压力：0.50kg/cm²，助燃气为空气；

分流比为30∶1；

(5)单糖结果分析：

单糖组分比例以肌醇为内标，以内标法测定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。