[发明专利]一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，尤其是一种基于气相色谱的表征甘露聚糖肽含量的方法，属于检测技术领域。

背景技术

甘露聚糖肽(Mannatide)曾用名：多抗甲素(PolyactinA，PAA)，是由α-溶血性链球菌(alpha-Hemolytic streptococci)33#菌株经发酵培养，提取制备的多糖类物质。它具有抑制肿瘤细胞生长与代谢，促进造血干细胞生长，增强免疫细胞活化增殖及特异抗体生成，提高外周血白细胞数，改善机体抗应激能力及抗炎等多种生理活性。该药作为治疗肿瘤的辅助药物，能够减轻放、化疗的毒副作用，增强和调节免疫功能；对贫血、血细胞减少症、过敏性关节炎、多种口腔粘膜病等非肿瘤疾病都有很好的治疗效果。

甘露聚糖肽不仅可以治疗人体的多种疾病，在畜牧生产中合理运用该药品，也可以起到很好的效果，具有光明的市场前景。但在发酵生产当中，对发酵情况的监控多依靠对发酵液中菌体的形态学观察及发酵时间等经验值，缺乏对发酵情况的有效评估质量标准，而以发酵产物甘露聚糖肽，含量作为质量标准是一种可行的方案。甘露聚糖肽可以分解为碱性多肽和甘露聚糖两部分，甘露聚糖肽经水解后测得含甘露糖含量为87.7-90.3％，根据甘露聚糖的特性可对发酵产物进行检测以表征甘露聚糖肽的含量。冯锁民利用Molisch反应使甘露糖与α-萘酚显色形成橙红色物，在490nm处检测甘露糖吸收度表征产物含量，但是培养基中添加的其他还原糖也会与α-萘酚发生显色反应，从而干扰测定结果。张运涛建立了紫外分光法直接测定啤酒酵母中甘露糖含量的方法。甘露糖在90％H₂SO₄溶液中脱水生成5-羟甲基-2-呋喃醛，添加NaCl-H₃BO₃，使5-羟甲基-2-呋喃醛转化为5-氯甲基-2-呋喃醛，此转化量与甘露糖的量呈线性关系，测定前后两次在280nm处的吸光值之差，得出甘露糖含量。

然而，发酵液成分较复杂，可能含有其他有紫外吸收的物质对甘露糖的含量测定有干扰，有很大局限性，不能准确反应甘露聚糖的含量。为此，本发明通过先对发酵液进行粗提纯，甘露聚糖的酸解，衍生化及气相色谱(GC)分离-氢火焰离子鉴定器(FID)检测发酵液中甘露糖单体含量，排除其他单糖因素的干扰，表征产物甘露聚糖肽的含量，为发酵过程的实时监控提供有据可依的数据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠、较简便且有应用价值的测定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是对甘露聚糖肽进行酸解获得甘露糖单体，再将甘露糖单体进行衍生化，利用气相色谱检测甘露糖含量，进而表征甘露聚糖肽的含量。

所述甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)，所述百分比为质量百分比。

所述酸解是将甘露聚糖肽用1-2M H₂SO₄于105℃进行酸解反应，1M与2M H₂SO₄可以达到同样的水解效果，反应结束后加入肌醇内标、混匀，用BaCO₃分次加入中和，振荡、离心取上清液，进行冷冻干燥。所述甘露聚糖肽经过粗纯化，去除分子量小于10KD及大于100KD的杂质。

所述甘露糖单体的衍生化，是称取10mg盐酸羟胺溶于0.5mL吡啶中，再将甘露聚糖肽酸解产物的冻干物加入到盐酸羟胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

所述气相色谱检测甘露糖含量的条件是：

色谱柱：OV1701石英毛细管柱，30m，I.D.0.53mm；

检测器：FID(氢火焰离子鉴定器)；

气化室温度：260℃，检测器温度：250℃；

柱温：程序升温：起始温度120℃，保持3min，每分钟升10℃，至195℃，保留0.1min，每分钟升3℃，至240℃，保留10min；

载气压力(N₂)：0.60kg/cm²；

燃气压力(H₂)：0.65kg/cm²；

助燃气压力(空气)：0.50kg/cm²；

分流比为30∶1。

所述方法应用于测定发酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的步骤为：