[发明专利]一种烟草空茎病菌的快速分离筛选和保存方法

权利要求书

1.一种烟草空茎病菌的快速分离筛选和保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、烟草空茎病原菌的分离筛选方法

(1)标样的制备：

选取具有烟草空茎病典型症状的新鲜病茎用蒸馏水洗净，经75％的乙醇3-5s再用0.1％升汞溶液表面消毒2-2.5min后，用无菌去离子水冲洗2-4次，然后无菌条件下在其病健交界处，切割大小为0.5-1cm×0.5-1cm，且深至维管束组织的病组织块或截成长1-1.5cm病茎小段；

(2)烟草空茎病原菌的分离筛选：

①结晶紫聚果胶酸盐(CVP)培养基的配制：分别将结晶紫水溶液1mL，CaCl₂·2H₂O 3mL，NaNO₃ 1g，聚果胶酸钠9g，1mol/L NaOH 5mL，十二烷基硫酸钠0.5mL，琼脂5g加入500mL蒸馏水溶解、摇匀，常规湿热灭菌后制得；

②将具有维管束组织的病组织块或病茎小段接种到盛有结晶紫聚果胶酸盐(CVP)选择性培养基的灭菌培养皿内，且具有维管束组织的一面必须向上，然后放在28-32℃、RH≥95％的人工气候箱中培养48-72小时后观察；挑选病组织块或病茎小段周边，生长旺盛时期的呈典型杯状的深度凹陷、边缘齐切的单菌落生长的菌体，即为烟草空茎病原菌；

b、复合包埋固定化造粒保存法：

(1)预处理液的配制：分别取50mL甘油+50mL二甲基亚砜+5g酵母浸粉加入蒸馏水溶解、定容至1000mL，摇匀，常规湿热灭菌后制得；

(2)4.5％复合包埋固定化液的配制：分别称取25g海藻酸钠、5g瓜尔豆胶、10g淀粉进行混合复配后，加入蒸馏水，且在60℃水浴促其加速溶解，用玻璃棒不时搅拌均匀，室温下定容至1000mL，常规湿热灭菌后制得；

(3)烟草空茎病原菌的复合包埋固定化和造粒：

①复合包埋固定化

I、将处在生长旺盛时期的烟草空茎病原菌的典型的单菌落添加入预处理液中充分混合摇匀，并且混合24h，使混合液的细菌浓度为2×108CFU/mL，即配制成浓度为2×108CFU/mL细菌悬浮液；

II、将2×108CFU/mL细菌悬浮液加入4.5％复合包埋固定化液中进行混合，连续摇匀制得菌液溶胶；

②造粒：将混匀的菌液溶胶用灭菌的18G-20G针头的注射器吸取，均匀用力挤压使菌液溶胶缓慢均匀地形成含病原菌的小球颗粒，并将造好的小球颗粒再放在2％氯化钙溶液中，置于4℃冰箱中进行固定化30h；

(4)烟草空茎病原菌的保存：

将复合包埋固定化好的含病原菌的小球颗粒1-1.5g置于灭菌的2mL的离心管或1.8mL的菌种保存管中，用灭菌的滤纸吸取管内多余的液体，旋盖或扣盖盖紧后，然后用灭菌的封口膜封口，放入-80℃冰箱中恒温保存。