[发明专利]一种烟草空茎病菌的快速分离筛选和保存方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物的分离筛选和保存技术领域，具体涉及一种烟草空茎病菌的快速分离筛选和保存方法。

背景技术

烟草空茎病(Tobacco hollow stalk)是当前烟草生产上“四大细菌性病害(烟草青枯病、烟草野火病、烟草角斑病和烟草空茎病)”之一，该病广泛分布于我国各类烟区，尤其以南方烟区发生为害较为严重，该病害已成为烟草生产的主要障碍之一。

重要烟草病原菌保存技术是植物保护工作中的一项常规技术。其目的是在人工创造的条件下尽量减慢或停止菌种的生长繁殖，使其处于休眠状态，减低菌种的变异率，在较长时期内保持着原有的生命力、并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变，以便为植物病害科研、试验提供大量可靠的优质病原菌种，具有的理论和现实意义。

烟草空茎病原菌为胡萝卜软腐氏杆菌(Erwinia carotovora subsp)，其寄主极为广泛，现有技术可实现对该菌的分离、培养和保存，见《一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定》(远方，屈淑平，崔崇士，曹鸣庆，马荣才，微生物学报，2004，44(2)：136-140页)，其采取的培养方式为：将待分离的具有典型发病症状的腐烂组织的边缘比较硬的部位切病组织块，用70％的酒精中浸2～3s后，用灭菌去离子水洗3次等进行表面消毒后，转移到含有0.5mL无菌的生理盐水(0.85％NaCl)无菌培养皿中，用灭菌的玻棒将病组织捣碎，无菌条件下于室温静置10～15min，使病组织中的细菌流入水中，形成细菌悬浮液。然后用灭菌的移植环蘸取菌悬液在LB平板上划线培养，放在28℃培养16～20h。从中挑取不同的单菌落进一步划线培养，转接纯化6～7次。根据软腐欧文氏菌能在结晶紫果胶培养基(CVP)上产生很深凹陷的特征，从凹陷中心挑取典型菌落在肉汁胨培养基上划线纯化，进一步挑取单菌落纯化后，转入斜面培养、保存。该方式存在的不足是：病菌在人工培养基上转接多次会导致病菌的变异、高侵染力等一些固有的特性很易丧失；而且有可能因为病菌数量少分离不到病菌。

目前，烟草空茎病菌株保存方法主要有定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、沙土保藏法、冷冻真空干燥保藏法、斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、脱脂奶保藏法等〔方中达编著的《植物病研究方法》(中国农业出版社，1998，187-189)〕。常用的较理想的烟草空茎病菌保存方法是液氮法和石蜡覆盖保藏法，但液氮法保藏菌种需要一定的专用设备，成本费用较高并且操作复杂，且冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌种后不得重新冷冻或再次使用等；石蜡覆盖保藏法缺点是操作复杂，不适于菌种频繁使用，且保存过程中试管必须直立存放，占空间大，不便携带，并且菌种复苏过程中液体石蜡的易燃性会给操作带来不便；实验室常用的方法是普通冰箱低温继代培养保存法，此法操作简单，菌种取用方便，但长时间保存由于其培养基容易失水干缩常导致菌种失活，一般3个月必须转管1次，如保存的菌种较多则费时费力，最大的问题是随着继代培养次数的增加，容易引起菌种退化和产生遗传变异。但不管哪一种菌种保藏最主要的缺点是菌种在长期传代保藏过程中易发生变异及退化，有毒力的细菌毒力可减弱，且随菌种而异。另外，标准菌种的传代次数不得超过5代等要求。为了防止烟草空茎病菌在人工培养基上连续传代，出现致病力迅速下降或其它遗传性状的改变的问题，以及现有技术保存菌种的效果不确定的问题，迫切需要研究开发一种适合烟草空茎病菌种保存的经济有效，并能保持其高侵染力的保存方法，以推延其变异时间并保持菌种原有各种生物学特征。

发明内容

本发明目的在于提供一种烟草空茎病菌的快速分离筛选的技术方法，以一步实现高侵染力烟草空茎病原菌的选择性分离与筛选；提供适合烟草空茎病菌保存的预处理液、保存液和4.5％复合包埋固定化液；提供一种适合烟草空茎病原菌的复合包埋固定化和造粒的技术方法。

为了达到上述目的，本发明所采取的技术方案主要包括以下步骤：

1、烟草空茎病原菌的分离筛选方法

(1)标样的制备：选取具有烟草空茎病典型症状的新鲜病茎用蒸馏水洗净，经75％的乙醇3-5s再用0.1％升汞溶液表面消毒2-2.5min后，用无菌去离子水冲洗2-4次，然后无菌条件下在其病健交界处，切割大小约为0.5-1cm×0.5-1cm，且深至维管束组织的病组织块或截成长约1-1.5cm病茎小段；

(2)烟草空茎病原菌的分离筛选