[发明专利]微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：

第一步，重组表达载体pMV261-ksh的构建；

首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc²155且带有酶切位点的ksh基因；所述酶切位点分别为EcoRI和HindIII；所述ksh基因为3-甾酮-9α-羟基化酶基因；

其次，将其与克隆载体pMD-18T连接，以获得该基因的大量克隆；

再次，进行双酶切、片段纯化，之后与耻垢分支杆菌表达载体pMV261连接；

最后，将得到的连接体系转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到重组质粒；

第二步，重组菌株的构建；

第三步，菌种繁殖及发酵转化。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的重组质粒电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述耻垢分枝杆菌感受态细胞的制作方法：

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态；

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mL EP管内-70℃保藏备用。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中，先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀为15-20时，以20-50％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化。

5.根据权利要求4所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中发酵转化的条件为：温度25-32℃、发酵初始PH 6.0-8.0、溶氧量20-40％、培养转速150-200rpm、培养周期80-120h。

6.根据权利要求4所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：葡萄糖8-15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02-0.06g/L、CaCO₃ 4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，所述种子培养基的PH为6.0-8.0。

7.根据权利要求4所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.02-0.06g/L，CaCO₃ 4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃ 0.5-1.5g/L，所述发酵培养基的PH为6.0-8.0。

8.根据权利要求4所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1.5-3.0％。