[发明专利]微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法

说明书

本发明提出了一种微生物发酵生产9α‑羟基雄烯二酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α‑羟基雄烯二酮，包括如下步骤：重组表达载体pMV261‑ksh的构建；重组菌株的构建；菌种繁殖及发酵转化。本发明通过基因工程手段获得3‑甾酮‑9α‑羟基化酶基因(ksh)过表达的基因工程菌株，该菌株经过120h发酵可以使植物甾醇的转化率高达95％以上，具有产率高、副产物少、发酵时间短，且提取简单、污染小、环保压力小等特点，极具工业生产的优势。

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，特别是微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法。

背景技术

9α-羟基雄烯二酮(9α-hydroxy androstenedione)简称9α-OH AD(结构式如下所示)，最早是由诺卡氏菌发酵液中分离得到的一种甾体物质。9α-OH AD可用于合成皮质激素、抗雄性激素、抗雌性激素及避孕功能药物，是一种非常重要的甾体激素中间体。

目前用于微生物发酵生产9α-OH AD的底物主要有两种方法：第一种方法是采用诺卡氏菌(Nocardia)、红球菌(Rhodococcus)、棒杆菌(Corynebacterium)及Cylindrocarponradicicola对底物雄烯二酮(AD)进行9α-羟基化，生成9α-羟基雄烯二酮(9α-OH AD)。如专利“利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法”(公开号CN 103361394A，申请号201310342583.1)公开了一种利用红平红球菌发酵转化4-雄烯二酮生产9α-OH AD的方法，但是该法存在转化率低、产物浓度低、生产成本高等缺陷，使得其不具备工业化生产的优势；另一种方法是利用分枝杆菌或偶发分支杆菌对单一或多种植物甾醇底物进行侧链降解以及9α-羟基化等一系列生化反应生成9α-OH AD。如专利“一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法”(公开号CN 103343155A，申请号201310259697.X)提出了一种利用偶发分枝杆菌ATCC35855为生产菌种，以植物甾醇为底物生产9α-OH AD 的方法，植物甾醇的转化率为60％左右，专利“发酵生产9-OH-AD的耻垢分枝杆菌、菌剂、制备方法和应用”(申请号201310628652.5，公开号CN 103667126A)中诱变得到一株的耻垢分枝杆菌(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013544)，此菌株有效抑制了9α-OH AD的1,2位脱氢，最终9α-OH AD质量收率可达到50-55％。

无论是从发酵工艺对环境的污染，还是从产物收率和纯度来讲，目前已经公开的方法都不适合工业化生产9α-OH AD。

3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体代谢降解途径中的关键酶，其具有两项重要作用：一是KSH能在甾体母核9α为导入羟基；二是作为甾醇微生物降解侧链制备雄甾酮类化合物的关键酶，KSH与3-甾酮-△¹-脱氢酶共同作用使母核开环，最终降解为水和二氧化碳。通过为该基因进行改造可获得生产4-雄烯二酮、1,4-雄烯二酮或9α-羟雄烯二酮等重要甾体药物中间体的基因工程菌。范书玥，魏巍等将分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01中的3-甾酮-9α-羟基化酶基因ksh连接于载体pET32a上，成功构建pET32a-ksh质粒，将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30％以上。其研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。

发明内容

本发明提出了一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，用于解决背景技术中的上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌发酵转化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮，包括如下步骤：第一步，重组表达载体pMV261-ksh的构建；第二步，重组菌株的构建；第三步，菌种繁殖及发酵转化。