[发明专利]一种检测K-ras基因突变的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液还包括锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引物对；其中，

用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，5’端生物素标记；

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示。

6.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引物对；其中，

用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，5’端生物素标记；

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针包括：

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：7所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：8所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：9所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：10所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：11所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：12所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上37G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：13所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上38G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针，其序列如SEQIDNO：15所示。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预处理液和后处理液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。