[发明专利]一种检测K-ras基因突变的试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变的检测，具体涉及一种检测K-ras基因突变的试剂盒。

背景技术

结直肠癌是严重危害人类生命健康的临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球约排在第三位，在中国约排在第四位，寻找有效的结直肠癌治疗手段一直是肿瘤学界研究的方向。近年来出现的新的治疗方法-靶向治疗，使个体化治疗成为可能，明显提高了肿瘤治疗的疗效。在结直肠癌得靶向治疗中，两种抗EGFR的单抗类药物西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)和帕尼单抗(Panitumumab，商品名Vectibix)能特异性的抑制具有野生型K-ras基因的结直肠癌组织细胞的生长，使病人的预后得到改善。因此，结直肠癌组织细胞中K-ras基因的突变状态是决定西妥昔单抗和帕尼单抗是否有效的关键指标。目前已知在结直肠癌治疗过程中，抗EGFR单抗治疗K-ras野生型患者的获益显著优于突变性患者，K-ras基因突变状态是抗EGFR单抗类药物疗效的独立预测指标。K-ras基因突变状态与抗EGFR单抗类靶向药物治疗结直肠癌病人的疗效密切相关，只对K-ras基因野生型患者推荐接受EGFR抑制剂治疗。

K-ras基因突变检测是目前临床医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有效的结直肠癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方法。目前在欧美等发达国家，K-ras基因检测已经成为结直肠癌患者内科治疗前的常规检查。在通常情况下，60％左右结直肠癌患者的K-ras基因都是野生型的，如果都接受了K-ras基因突变检测，通过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，有效率可达60％左右。所以，越早做K-ras基因检查，患者获益最大。

目前常用的K-ras点突变检测的方法有DNA直接测序法、单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读较复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。单链构象多态性分析与限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。荧光定量PCR法具有假阳性较高等缺点，难于大规模应用于临床诊断。

出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的检测K-ras基因突变的试剂盒及其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其具有低成本、易操作、耗时短、灵敏度高和特异性好等突出技术效果，可广泛应用于临床诊断。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。

本发明的试剂盒将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，可以在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交的操作耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。