[发明专利]一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。该方法是将SEQ ID No.2中自N端起第1‑972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因和SEQ ID No.4中自N端起第1‑390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。通过实验证明，在普通三角瓶中，一次转化能获得2g/L的透明质酸。诱导后菌体可以反复利用，进行多次的转化，HA的总产量可达4‑5g/L。

技术领域

本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体涉及一种高效产透明质酸的重组菌的构建方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是一种酸性的粘多糖，最早由美国哥伦比亚大学教授Meyer从牛眼睛玻璃体中分离得到。透明质酸是由等摩尔D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，分子量在10⁴～10⁷Da之间，是胞外基质的重要组成部分。透明质酸是线性大分子，在水溶液中形成的网状结构赋予其溶液独特的流变学特性和依数性，因此被广泛应用于医药、化妆品和食品等多个领域。

目前报道的HA的生产方法有以下3种：天然产物提取法、化学合成法和微生物发酵法。其中，天然产物提取法是从动物的组织中直接提取HA；化学合成法是通过化学合成的方法合成“玻璃酸氧氮杂环戊烯衍生物”，然后在降解酶的作用下制备出HA衍生物和酶的复合体，最后清除酶，获得HA；微生物发酵法是经过微生物进行发酵培养，从发酵液中分离纯化得到HA。目前，工业生产的HA主要通过天然产物提取法和微生物发酵法获得。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高效产透明质酸的重组菌pBPAB/BW25113的构建方法。

上述方法中，所述的重组菌是将PmHasA蛋白的编码基因和PmHasB蛋白的编码基因导入宿主大肠杆菌中得到的。

上述方法中，所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白序列的相似性超过97％；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白序列的相似性超过97％。

上述方法中，所述SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示的PmHasA蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示的PmHasB蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

上述方法中，所述的PmHasA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第1-972位氨基酸所示；所述的PmHasB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4中自N端起第1-390位氨基酸所示。

上述所述的宿主大肠杆菌为E.coli BW25113。

上述所述的编码基因是通过如下方式导入的：将编码基因插入载体pBAD-HisB的多克隆位点得到重组载体；将重组载体导入宿主菌中。

起始载体pBAD-HisB含有pBR322的复制起始位点、氨苄抗性基因、AraC基因(L-阿拉伯糖调节基因)、araBAD启动子和rrnB转录终止子，公众可从Invitrogen公司购买获得，产品目录号：V430-01。

宿主菌E.coli BW25113，基因型：F^-，Δ(araD-araB)567，ΔlacZ4787(::rrnB-3)，λ^-，rph-1，Δ(rhaD-rhaB)568，hsdR514。E.coli BW25113在葡萄糖耗尽，阿拉伯糖存在的情况下，会启动araBAD启动子下游基因的表达。公众可从北京碧橙蓝生物科技有限责任公司获得，产品目录号为OEC5042。

上述所述的重组菌pBPAB/BW25113在制备透明质酸中的应用也是本发明的一个目的。