[发明专利]含离子液体共溶剂介质中制备(R)‑3,5‑双三氟甲基苯乙醇的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种基因工程菌及其应用，特别涉及一种重组大肠杆菌工程菌及其在含离子液体共溶剂体系中生物还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法。

(二)背景技术

2003年美国FDA批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂药物，即阿瑞吡坦(Aprepitant，商品名：)。该药物通过与NK-1受体结合从而阻断P物质的作用来达到止吐的效果，广泛应用于治疗癌症病人化疗时产生的恶性呕吐的副作用。2008年在美国、瑞典、捷克、葡萄牙和英国等国上市了另一个止吐药物，即福沙吡坦(Fosaprepitant，商品名：)，该药物是阿瑞吡坦的前体药物，在体内能迅速转化成阿瑞吡坦从而发挥止吐效果。(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇是合成阿瑞吡坦和福沙吡坦等化疗止吐药物的关键手性模块。

离子液体是一类具有不易挥发，不易燃和高稳定性等独特性能，可作为纯溶剂，辅助溶剂，或与其他溶剂一起构成两相体系广泛应用于生物催化、有机合成、化学分离等反应过程。离子液体可通过匹配特定需求的阳离子或阴离子改变其性质，从而有利于提高生物催化剂的催化效率。近年来，有关含离子液体介质中的生物催化过程研究使得生物催化剂的催化活性、立体选择性和稳定性相应的得到提高。

离子液体介质中重组工程菌生物还原3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)的反应过程如图1所示。

本申请人的在先申请中国专利2013101896727(公开号CN103421823A)提供了一种以重组工程菌或其表达的短链脱氢酶为生物催化剂，对一些潜手性酮不对称还原获得相应手性醇的方法。该方法在水相体系中进行，且只有在较低的底物浓度下(50mM)，产率才能达到90％以上，当底物浓度大于200mM时，由于底物3,5-双三氟甲基苯乙酮在水相中的低溶解性引起的传质问题，以及底物对细胞的潜在毒性限制了反应的底物浓度的进一步提高，造成产率偏低。

本申请采用含离子液体介质体系进行重组工程菌催化不对称还原反应，由于离子液体对底物具有增溶作用，可有效解决非天然底物水难溶性问题；且离子液体的加入可改变作为催化剂的全细胞的细胞膜通透性，减少底物和产物的抑制作用；从而提高了还原反应的效率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种在含离子液体共溶剂的反应体系中有效提高重组基因工程菌在高底物浓度(200～1500mM)条件下不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的产率的新方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种在含离子液体共溶剂体系中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法为：以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以式(Ⅰ)所示离子液体和pH6.0～8.0(优选pH7.0)磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，于20～45℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应完全后，反应液经分离纯化得到(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇；所述重组基因工程菌是由来源于雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904短链脱氢酶突变体基因构建的重组表达载体转化宿主菌获得的，所述短链脱氢酶突变体基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示；所述底物的初始浓度为200mM～1500mM(优选1200mM)，所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为20～200g/L(优选50g/L)，所述离子液体的质量用量以反应体系总体积计为10～50g/L(优选35g/L)，所述异丙醇的体积终浓度为10～50％(优选20％)；

[N_R1,R2,R3,R4]L

(Ⅰ)

式(Ⅰ)中阳离子为取代季铵盐，阴离子为天然氨基酸、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐，其中取代季铵盐的取代基R1、R2、R3和R4各自独立为C1～C4的烷基。