[发明专利]一种H-2Kd基因siRNA表达质粒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种H-2K^d基因siRNA表达质粒及其制备方法与应用。

背景技术

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是编码主要组织相容性抗原的基因群，其表达产物是参与抗原提呈和T细胞激活的关键分子，H-2K^d是小鼠MHC I类分子，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用。双链RNA(dsRNA)诱导与之同源的mRNA降解，从而导致转录后基因缄默(post transcriptional genesilencing，PTGS)的现象或机制被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。

RNAi现象和机制的研究进展非常迅速。特别是近年来，RNAi已被发展成为一个新的强有力的工具，在反向基因组学、基因治疗、抗病毒感染等方面显示出了巨大的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种H-2K^d基因siRNA表达质粒及其制备方法与应用，为进一步研究H-2K^d基因的功能及制造MHC表达下降动物模型奠定基础。

本发明是这样实现的，一种H-2K^d基因siRNA表达质粒，包括序列如SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸1和序列如SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸2配对结合而成的双链寡核苷酸，其载体为线性化的pSilencer3.0-H1。

本发明进一步提供了上述H-2K^d基因siRNA表达质粒的构建方法，包括以下步骤：将合成的寡核苷酸1和寡核苷酸2等量混合，95℃作用3min，37℃孵育1h；将结合的双链寡核苷酸与带有BamHI和HindIII粘性末端的pSilencer3.0-H1载体连接，得到H-2K^d基因siRNA表达质粒。

本发明进一步提供了上述H-2K^d基因siRNA表达质粒在抑制H-2K^d基因表达方面的应用。

本发明克服现有技术的不足，提供一种H-2K^d基因siRNA表达质粒，在本发明中，由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，能够显著降低制备siRNA的成本。可以自行制备siRNA而不受数量的限制。质粒DNA与小鼠脾LAK细胞混合培养后，H-2K^d分子的表达率明显下降，同时，MTT法测定不同组别的细胞活性没有明显改变，倒置显微镜下观察，细胞形态亦没有明显的改变。质粒DNA及脂质体对细胞无明显毒副作用，对H-2K^d蛋白表达的抑制作用不是通过非特异性毒副作用实现的，从而证明是抑制H-2K^d蛋白表达的有效方法。本研究采用pSilencer3.0-H1成功构建了针对H-2K^d基因的siRNA表达质粒并抑制其表达，为下一步研究H-2K^d基因的功能及制造外周血H-2K^d下降的动物模型奠定基础。

附图说明

图1是本发明实施例中琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明实施例中插入片断的测序图；

图3是本发明实施例中FCM检测LAK细胞表面流式细胞H-2K^d的荧光直方图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株

质粒pSilencer3.0-H1购自Ambion公司；工程菌DH5a由山东大学医学院免疫研究所馈赠。

1.1.2主要材料和试剂

T4DNA连接酶、质粒的提取及纯化试剂购自Promega公司；RPMI1640培养基、胎牛血清，购自美国Gibco公司；脂质体购自Invitrogen公司；小鼠淋巴细胞分离液购自上海生化试剂公司；FITC标记的抗H-2K^d单克隆抗体及同型对照购自美国BD公司。

1.1.3测序引物

质粒中插入片段的测序采用M13通用引物：

Forward：5′-CACGACGTTGTAAAAGAC-3′